GB/'r18090-2000

前言

豬繁殖和呼吸綜合癥(簡(jiǎn)稱(chēng)PRRS)是由PRRS病毒引起的一種接觸傳染性疾病。各種年齡的豬均

易感染。妊娠母豬感染后可引起流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎及弱胎，仔豬可發(fā)生呼吸障礙和高病死率，其他豬

常呈隱性感染或僅出現(xiàn)輕度的呼吸道癥狀。PRRS病毒有歐洲型和美洲型兩種主要抗原型，分別以IN

和VR-2332為代表株，型間具有明顯的抗原交叉反應(yīng)性。據(jù)現(xiàn)有資料，我國(guó)流行的毒株為美洲型本病

幾乎發(fā)生于世界各養(yǎng)豬國(guó)家，并于九十年代中期傳入我國(guó)。由于其對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的嚴(yán)重威脅性，國(guó)際獸疫局

(1996)已將本病列為B類(lèi)傳染病。

大連動(dòng)植物檢疫局在國(guó)內(nèi)率先開(kāi)展了PRRS的研究工作，建立了具有與國(guó)際同等水平的病毒分離

鑒定、間接免疫熒光試驗(yàn)和血清中和試驗(yàn)等診斷方法。其他單位也相繼建立了多種酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

等

本標(biāo)準(zhǔn)是在綜合我國(guó)科研成果的基礎(chǔ)上，參照國(guó)際獸疫局(OIE)編寫(xiě)的《哺乳動(dòng)物、禽和蜜蜂A和

B類(lèi)疾病診斷試驗(yàn)和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)》(第三版，1996)編寫(xiě)的。其技術(shù)內(nèi)容與OIE所推薦的基本一致。

本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B和附錄C都是標(biāo)準(zhǔn)的附錄。

本標(biāo)準(zhǔn)由農(nóng)業(yè)部提出。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位:中華人民共和國(guó)大連動(dòng)植物檢疫局。

本標(biāo)準(zhǔn)起草人:孫穎杰、蘇永生、潘鳳城、孫延峰、簡(jiǎn)中友。

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

豬繁殖和呼吸綜合癥診斷方法

Diagnosticmethodsofporcinereproductive

andrespiratorysyndrome

GB/T18090-2000

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬繁殖和呼吸綜合癥((PRRS)的診斷方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬繁殖和呼吸綜合癥的診斷。

2診斷方法的種類(lèi)和選用

PRRS的診斷方法有多種。依據(jù)臨床癥狀和病理變化只可作出初步診斷，確診必須依靠實(shí)驗(yàn)室檢

查。目前已建立和應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)有病毒的分離與鑒定、免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)UPMA)、間

接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(間接ELISA)和血清中和試驗(yàn)(SN)等。病毒的分離與

鑒定多用于急性病例的確診和新疫區(qū)的確定。其余4種方法主要用于檢測(cè)PRRS病毒抗體IPMA,IFA

和間接ELISA三者特異性相似，但以間接ELISA的敏感性最高。應(yīng)用這三種方法一般不易區(qū)別病毒的

抗原類(lèi)型，故多適用于確定病性。SN反應(yīng)具有明顯的抗原型別差異，因此，它既適用于確定病性，也適

用于鑒定病毒的抗原類(lèi)型。中和抗體出現(xiàn)最晚，不適合于早期診斷

本標(biāo)準(zhǔn)指定上述五種實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)為我國(guó)進(jìn)出境和國(guó)內(nèi)生豬PRRS的診斷方法，保證了我國(guó)對(duì)

PRRS的診斷與國(guó)外的一致性。在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，可根據(jù)需要和條件，從中選用1.2種方法即可。

3病毒的分離與鑒定

3門(mén)材料準(zhǔn)備

3.1.1器材:96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、微量移液器、恒溫水浴箱、二氧化碳(COQ)恒溫箱、普通冰箱及低溫冰

箱、離心機(jī)及離心管、組織研磨器、孔徑。.2hem的微孔濾膜、普通光學(xué)顯微鏡。

3.1.2試劑:RPM11640營(yíng)養(yǎng)液、犢牛血清、青霉素(10"IU/ml)與鏈霉素(100pg/mL)溶液,7.5%碳

酸氫鈉溶液等。

3.1.3細(xì)胞培養(yǎng)物:豬原代肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物((PAM)或MARC-145或HS2H細(xì)胞。PAM由無(wú)

PRRS豬獲取，并經(jīng)批次檢驗(yàn)合格，制備和檢驗(yàn)方法見(jiàn)附錄B.MARC-145或HS2H細(xì)胞由國(guó)家指定單

位提供

3門(mén).4樣品

3.1.4.1樣品的采取和送檢:在發(fā)病早期，無(wú)菌地采取病豬的血清或腹水對(duì)病死豬(如流產(chǎn)的死胎)和

撲殺豬(如弱胎豬)，應(yīng)立即采取肺、扁桃體和脾等組織數(shù)小塊，置冰瓶?jī)?nèi)立即送檢。不能立即檢查者，應(yīng)

放一25C一一30'C冰箱中，或加50%甘油生理鹽水,4℃保存送檢

3.1.4.2樣品的處理:血清和腹水可直接使用。肺、脾和扁桃體等組織可單獨(dú)使用，也可混合后使用。各

組織剪碎后研磨成糊狀，加入RPM11640營(yíng)養(yǎng)液，制成10%懸液，3000Xg離心15min，吸取上清液，加

入青霉素500IU/ml、鏈霉素500vg/ml

國(guó)家質(zhì)t技術(shù)監(jiān)督局2000一04一26批準(zhǔn)

、慶大霉素500pg/ml和兩性霉素B200pg/m1。懷疑有細(xì)菌

2000一10一01實(shí)施

GB/"r18090-2000

污染的樣品，也可用0.2pm微孔濾膜過(guò)濾處理

3.2操作方法

3.2，稀釋樣品:取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入細(xì)胞培養(yǎng)液RPM11640含犢牛血清lo0o,青霉素

100IU/mI、鏈霉素100pg/mL、慶大霉素50pg/mI、兩性霉素B10pg/mL,pH=7.2)90p.L，在Al和

C1孔內(nèi)加人同一份已處理的樣品各10pL(樣品lox稀釋)。將板輕輕搖動(dòng)后，從Al和C1排孔各取10

[LL分別移入BI和Dl排孔內(nèi)(樣品loox稀釋)。除第6和第12列留作正常細(xì)胞對(duì)照外，其他各孔的樣

品稀釋方法同上。振動(dòng)稀釋板后加蓋，置4'C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2.2制備細(xì)胞板:已建立的某些猴腎細(xì)胞系不能支持所有分離物特別是歐洲型病毒株的良好生長(zhǎng)，

因此病毒分離應(yīng)首選PAM細(xì)胞，先將PAM細(xì)胞泥用細(xì)胞培養(yǎng)液RPM11640稀釋?zhuān)辜?xì)胞終濃度為

1X10`細(xì)胞/mL。或?qū)ARC-145或HS,H細(xì)胞用MEM細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液稀釋?zhuān)?xì)胞終濃度為5X10‘細(xì)胞/

ml。然后，在另一塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上每孔加入上述細(xì)胞懸液100VL,

按照土述操作，每板可檢測(cè)20份樣品，每份樣品重復(fù)2個(gè)滴度第6和第12列留作正常細(xì)胞對(duì)照

(不接種樣品)

3.2-3接種樣品:由樣品稀釋板每孔內(nèi)各吸取稀釋的樣品液50pL，接種于已形成細(xì)胞單層的細(xì)胞板

相應(yīng)的孔內(nèi)(第一代)。細(xì)胞板加蓋后，放入370C5%二氧化碳保濕恒溫箱中培養(yǎng)，每天觀察致細(xì)胞病變

作用(CPE)，連續(xù)觀察2d-5d,CPE通常在接種后1d--4d內(nèi)出現(xiàn)，主要呈現(xiàn)細(xì)胞圓縮、聚集、固縮，最

后溶解脫落

3.2.4培養(yǎng)物盲傳:根據(jù)第一代培養(yǎng)物CPE出現(xiàn)的情況(通常在接種后的第2d--3d)安排盲傳。盲傳

時(shí)，不論CPE有無(wú)，一律各取孔內(nèi)混懸液25PL，移入新細(xì)胞板相應(yīng)的孔內(nèi)。再于370C5環(huán)二氧化碳保濕

恒溫箱中培養(yǎng)2d-5d，每夭觀察CPE.

13結(jié)果的判斷和解釋

在第二代培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，不論是否出現(xiàn)CPE，對(duì)所有的孔必須采用免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)QPMA)

或間接免疫熒光試驗(yàn)QFA)進(jìn)行終判;只要對(duì)PRRS病毒陽(yáng)性血清呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，則被認(rèn)定為PRRS病

毒分離陽(yáng)性。

4免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)(IPMA)

41材料準(zhǔn)備

4門(mén)門(mén)器材微量移液器、倒置顯微鏡等。

4-1.2試劑

4.1-2.1IPMA診斷板的制備:見(jiàn)附錄Bo

4.1.2.2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清和兔抗豬過(guò)氧化物酶結(jié)合物均由國(guó)家指定單位提供。使用前按

說(shuō)明書(shū)規(guī)定用血清稀釋液稀釋至工作濃度

4.1.2.3洗滌液、血清稀釋液和顯色/底物溶液依照附錄A自行配制

4.1.3樣品:采集被檢豬血液分離血清，血清必須新鮮透明不溶血無(wú)污染，密裝于滅菌小瓶?jī)?nèi)，4'C或

一30C冰箱保存或立即送檢。試驗(yàn)前將被檢血清統(tǒng)一編號(hào)，并用血清稀釋液作20倍稀釋

4.2操作方法

參照?qǐng)DI

GB/T18090--2000

慶門(mén)廠歹壓，}ss

ss

}玉翻「一]巨口巨二「巨二巨一

【下門(mén)廠P1巨井

S7

1飛三壓刃巨]巨習(xí)巨口〔二巨二巨一

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嚇門(mén)巨二〔二廠二〔二巨〕巨二巨][衛(wèi)巨二l一

壓]二區(qū)二巨二〔二〔二〔二巨;巨口【二「二〔二巨口

S2

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3

區(qū)二【二一巨二巨二匡{巨二匡]〔二巨二巨習(xí)

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巨5S5一匹至〔二仁‘L二〔二一巨口〔二匕仁二仁二

ABCDEFGH

V,V'wV'V'wV'V'VV'V,V

V--感染PRRS病毒的細(xì)胞列戊一未感染PRRS病毒的細(xì)胞列;C一空白對(duì)照孔出一標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清對(duì)照孔;

N一標(biāo)準(zhǔn)陰性血清對(duì)照孔;S1,S2,S3等一被檢血清編號(hào)

圖1IPMA和IFA診斷板加樣示意圖

4.2.1取已作20倍稀釋的被檢血清加入IPMA診斷板同一排相鄰的2個(gè)病毒感染細(xì)胞孔(V')及其

后的1個(gè)未感染細(xì)胞孔(V-)內(nèi)(參照?qǐng)D1)，每孔50PL，同時(shí)設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清和空白

對(duì)照，以血清稀釋液代替血清設(shè)立空白對(duì)照.封板并于4℃條件下過(guò)夜。

4.2.2棄去板中液體，用洗滌液洗板3次，每孔100pL，每次1min-3min，最后在吸水紙上輕輕拍

干。

4.2.3每孔加人工作濃度的兔抗豬過(guò)氧化物酶結(jié)合物50pL，封板后放在保濕盒內(nèi)于37`C恒溫箱中感

作60min.

4.2.4棄去板中液體，洗滌三次，方法同4.2.2,

4.2-5每孔加入顯色/底物溶液50IL，封板于室溫((18'C-24C)下感作30min,

4.2.6棄去板中液體，洗滌1次，方法同4.2.2，再用三餾水洗滌2次，最后在吸水紙上輕輕拍干，待

檢。

4.3結(jié)果判定與解釋

將IPMA診斷板置于倒置顯微鏡下判讀。在對(duì)照標(biāo)本都成立的前提下，即空白對(duì)照感染細(xì)胞孔

(P"V,)和未感染細(xì)胞孔((P"V-)均應(yīng)為陰性反應(yīng);標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清對(duì)照感染細(xì)胞孔((P"V`)應(yīng)呈典型

陽(yáng)性反應(yīng)，未感染細(xì)胞孔((P·V-)應(yīng)為陰性反應(yīng);標(biāo)準(zhǔn)陰性血清對(duì)照感染細(xì)胞孔(N·V`)和未感染細(xì)

胞孔(N"V-)均應(yīng)呈陰性反應(yīng);被檢血清未感染細(xì)胞孔(V-)不應(yīng)出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。被檢血清標(biāo)本的細(xì)胞

漿(可能僅見(jiàn)于部分細(xì)胞)出現(xiàn)彌漫狀或團(tuán)塊狀棕紅色著染者，判讀為免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)陽(yáng)性，記

作IPMA(+);無(wú)棕紅色著染者，判讀為免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)陰性，記作IPMA(一)。IPMA(+)者

表明被檢豬的血清中含有PRRS病毒的抗體。

5間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)

5.1材料準(zhǔn)備

5門(mén)門(mén)器材:熒光顯微鏡、恒溫箱、保濕盒、微量移液器等

5.1.2試劑

5.1-2.1IFA診斷板的制備:見(jiàn)附錄B.

5.1.2.2兔抗豬異硫氰酸熒光黃(FITC)結(jié)合物、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，由國(guó)家指定單位提

供

5.1.3樣品:采集被檢豬血液，分離血清，血清必須新鮮、透明、不溶血、無(wú)污染，密裝于滅菌小瓶?jī)?nèi),4C

或一30〔冰箱保存或立即送檢。試驗(yàn)前將被檢血清統(tǒng)一編號(hào)，并用PBS液作2。倍稀釋

5.2操作方法

5.2-1取IFA診斷板，編號(hào)，棄去板中的乙醇溶液，置超凈工作臺(tái)中風(fēng)干，每孔加100FA-PBS液洗-

次，棄去PBS液并在吸水紙上輕輕拍干。

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5.2.2在編號(hào)對(duì)應(yīng)的孔內(nèi)加入20倍稀釋的被檢血清:同一排相鄰的感染細(xì)胞孔2個(gè)及其后無(wú)感染細(xì)

胞孔1個(gè)，每孔100川，同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性血清及空白對(duì)照，空白對(duì)照是用PBS液代替血清。置37C

恒溫箱中感作45min,

5-2.3棄去板中血清，用PBS液洗板4次，每孔100t}L，每次3min，最后在吸水紙上輕輕拍干。

5.2.4每孔加入工作濃度的兔抗豬FITC結(jié)合物50PI，在37'C恒溫箱中感作45min

5.2.5棄去板中結(jié)合物，同5.2.3方法洗滌3次后，最后在吸水紙上輕輕拍干

5.3熒光顯微鏡檢查及判定與解釋

熒光顯微鏡采用藍(lán)紫光(激發(fā)濾板通常用BG,2，吸收濾板用OG,或GGg)，在5倍一10倍目鏡下檢

查標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清對(duì)照中感染細(xì)胞孔((P"V十)應(yīng)出現(xiàn)典型的特異性熒光，而未感染細(xì)胞孔((P-V-)不應(yīng)

出現(xiàn)特異性熒光;標(biāo)準(zhǔn)陰性血清對(duì)照、空白對(duì)照中感染細(xì)胞孔(N-V')和未感染細(xì)胞孔(N-V-)均不

應(yīng)出現(xiàn)特異性熒光;被檢血清對(duì)照中未感染細(xì)胞孔((C·V-)不應(yīng)出現(xiàn)特異性熒光。被檢血清樣品感染

細(xì)胞孔(N-V')出現(xiàn)特異性胞漿亮綠熒光的判為陽(yáng)性;否則，判為陰性

6間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(間接ELISA)

6門(mén)材料準(zhǔn)備

6.1.1器材:96孔平底微量反應(yīng)板、微量移液器、酶標(biāo)測(cè)定儀、恒溫箱、保濕盒等。

6.1.2試劑

6.1.2.1PRRS病毒抗原和正常細(xì)胞對(duì)照抗原，由國(guó)家指定單位提供。使用前，按說(shuō)明書(shū)規(guī)定用抗原稀

釋液稀釋至工作濃度

6.1.2.2免抗豬壇G辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物(簡(jiǎn)稱(chēng)酶標(biāo)抗體)由國(guó)家指定單位提供。使用前按說(shuō)明書(shū)

規(guī)定用血清稀釋液稀釋至工作濃度。

6.1.2.3PRRS病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，由國(guó)家指定單位提供。使用前按說(shuō)明書(shū)規(guī)定用血

清稀釋液稀釋至工作濃度。

6.1.2.4抗原稀釋液、血清稀釋液、洗滌液、封閉液、底物溶液、終止液等，依照附錄A自行配制

6.1.3樣品采集被檢豬血液，分離血清，血清必須新鮮、透明、不溶血、無(wú)污染，密裝于滅菌小瓶?jī)?nèi)，4C

或一30'C冰箱保存或立即送檢。試驗(yàn)前將被檢血清統(tǒng)一編號(hào)，并用血清稀釋液作20倍稀釋。

6.2操作方法

參照?qǐng)D2

GH

嚇門(mén)廳不醫(yī)一壓3廠二巨廠刁匡口巨廠門(mén)巨二「口

巨二國(guó)畫(huà)國(guó)「二口巨二口口口口口

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S2

國(guó)畫(huà)巨二口巨二口口口口口

VCVCVGVGVCV(

6.2.1

照杭原

夜

6.2.2

V一為PRRS病毒抗原包被列;C一正常細(xì)胞抗原包被列;P-標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清對(duì)照孔;

N-標(biāo)準(zhǔn)陰性血清對(duì)照孔;S1,S2,S3等一被檢血清編號(hào)

圖2間接ELISA診斷板加樣示意圖

包被抗原:取96孔平底微量反應(yīng)板，于奇數(shù)列加工作濃度的病毒抗原，偶數(shù)列加工作濃度的對(duì)

梅孔100討_(參照?qǐng)D2)，封板，置保濕盒內(nèi)放37'C恒溫箱中感作60min，再移置4℃冰箱內(nèi)過(guò)

洗板棄去板中包被液，加洗滌液洗板，每孔100kL，洗滌3次，每次1min。在吸水紙上輕輕拍

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千。

6.2.3封閉:每孔加入封閉液100I.L，封板后置保濕盒內(nèi)于37'C恒溫箱中感作60min

6.2.4洗滌:方法同6.2.2,

6.2.5加血清:反應(yīng)板按圖2編號(hào)后，對(duì)號(hào)加入已作稀釋的被檢血清、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清

每份血清各加2個(gè)病毒抗原孔和2個(gè)對(duì)照抗原孔，孔位相鄰。每孔加樣量均為100uL。封板，置保濕盒

內(nèi)于370C恒溫箱中感作30min,

6.2.6洗板:方法同6.2.2,

6.2.7加酶標(biāo)抗體:每孔加工作濃度的酶標(biāo)抗體100pL，封板，放保濕盒內(nèi)置37`C恒溫箱中感作

30min,

6.2.8洗板:方法同6.2.2,

6.2.9加底物:每孔加人新配制的底物溶液100uL，封板，在37'C恒溫箱中感作15min,

6.2-10加終止液:每孔添加終止液100PL終止反應(yīng)。

6.3光密度(OD)值測(cè)定與計(jì)算

6.3.1OD值測(cè)定:在酶標(biāo)測(cè)定儀上用A=650ran讀取反應(yīng)板各孔溶液的OD值，記入專(zhuān)用表格。

6.3.2OD值計(jì)算

按下式分別計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清和被檢血清與2個(gè)平行抗原孔反應(yīng)的OD值的平均

值。

標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清(P)與病毒抗原(V)反應(yīng)的均值P·V(ODs,a)按式((1)計(jì)算:

P·V(0D_)一[Al(OD_)+BI(ODsso)]/2···············??(1)

標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清(P)與對(duì)照抗原((C)反應(yīng)的均值P·C(OD-)按式(2)計(jì)算:

P·C(ODeso)=仁A2(ODsso)+B2(OD_)1/2··················??(2)

標(biāo)準(zhǔn)陰性血清(N)與病毒抗原(V)反應(yīng)的均值N·V(OD...)按式(3)計(jì)算:

N·V(OD_)二仁Cl(OD-)+Dl(ODsso)1/2···············??(3)

被檢血清(S)與病毒抗原(V)反應(yīng)的均值S·V(ODsso)按式(4)計(jì)算:

S·V(OD_)二[El(ODsw)+Fl(ODsso)1/2(以S1血清為例)······，··?(4)

被檢血清(S)與對(duì)照抗原(C)反應(yīng)的均值S·C(ODsso)按式(5)計(jì)算:

S·C(ODsso)=[E2(OD6so)+F2(ODsso)]/2(以S1血清為例)······??(5)

6.3.3按式((6)計(jì)算被檢血清OD值與標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清OD值的比值S/P,

S/P=[S·V(OD_)一S·C(OD_)1/[P·V(0D_)一P·C(OD6,o)]??(6)

6.4結(jié)果的判定與解釋

6.4.1有效性判定:P·V(OD...)與N·V(OD-)的差值必須大于或等于。.15。時(shí)，才可進(jìn)行結(jié)果判

定。否則，本次試驗(yàn)無(wú)效。

6.4.2判定標(biāo)準(zhǔn)與解釋

a)S/P比值小于0.3，判定為PRRS病毒抗體陰性，記作間接ELISA(一)。

b)S/P比值大于或等于。.3，小于。.4，判定為疑似，記作間接ELISA(士)。

C)S/P比值大于或等于。.4，判定為PRRS病毒抗體陽(yáng)性，記作間接ELISA(+)

間接ELISA(十)者表明被檢豬血清中含有PRRS病毒抗體。

了血清中和試驗(yàn)(SN)

7.1材料準(zhǔn)備

7.1.1器材:96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、微量移液器、二氧化碳(COO恒溫箱、倒置顯微鏡等。

7.1.2病毒:美洲標(biāo)準(zhǔn)株ATCCVR-2332或歐洲標(biāo)準(zhǔn)株LV，由國(guó)家指定單位提供。使用前按附錄C

方法滴定病毒效價(jià)后，用含20%健康豬新鮮血清的EMEM營(yíng)養(yǎng)液(pH7.2)將其稀釋至200TCID,o/

GB/T18090-2000

25ML作為工作病毒液

7.1.3細(xì)胞:MARC-145或HS,H傳代細(xì)胞，由國(guó)家指定單位提供。使用時(shí)，用細(xì)胞分散液消化、分散

細(xì)胞，計(jì)數(shù)，再用EMEM營(yíng)養(yǎng)液(含犢牛血清10yo，青霉素100IU/mL，鏈霉素100pg/mL,pH=7.2)

稀釋至10‘細(xì)胞/mL.

7.1.4試劑

7.1.4.1PRRS病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，由國(guó)家指定單位提供，使用前經(jīng)56℃滅活30min,

并按說(shuō)明書(shū)規(guī)定進(jìn)行稀釋。

7.1.4.2健康豬新鮮血清無(wú)菌采自3-8月齡的無(wú)PRRS的健康豬，可于一70℃低溫冰箱保存。使用

時(shí)不滅活

7.1.5樣品:無(wú)菌采集被檢豬血清，血清必須新鮮、透明、無(wú)溶血、無(wú)污染，密裝于滅菌小瓶?jī)?nèi)，4℃保存

或立即送檢，檢911前經(jīng)56℃滅活30min。由于中和抗體產(chǎn)生稍晚，故該血清以在疾病中后期或病毒感染

后2一3周時(shí)采集為宜。

7.2操作方法

參照?qǐng)D3

12345678910112

AR

GH

陣刃「，廠勺廠節(jié)廠二巨口r當(dāng)巴竺【二泣二泣二I二]

陣鉀「一州廠一廣，廠，廠刁巨二〔二〔二仁二【二二〔習(xí)

S2

門(mén)門(mén)口口口國(guó)口口巨二巨二巨二

S2

「，廠，廠下廠下「~門(mén)1N口「【二【二二仁二【二口

S3

門(mén)門(mén)曰門(mén)已)門(mén)

100

國(guó)口壓勺亡二

戶獷「一廣~l一「一廠門(mén)【，1100一「10「丁L4刃〔二

S4

門(mén)口口口口口

100

畫(huà)口回「二

S0二「二巨二仁二巨口I二)「口

100

巨=1仁口巨國(guó)〔二

▲

被檢血清毒性對(duì)照

▲

細(xì)胞對(duì)照

▲

病毒對(duì)照

▲

細(xì)胞對(duì)照

P一標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清對(duì)照;N一標(biāo)準(zhǔn)陰性血清對(duì)照;S1,S2,S3等一被檢血清編號(hào);100,10,1,0.1-病毒濃度TCID,,

圖3血清中和試驗(yàn)第1塊板加樣示意圖

7.2.1加營(yíng)養(yǎng)液:取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，編號(hào)，于各血清檢測(cè)孔內(nèi)加入EMEM營(yíng)養(yǎng)液(含10%犢牛血

清,100IU/ml，青霉素、100pg/mL鏈霉素,pH=7.2)25pL，細(xì)胞對(duì)照區(qū)各孔加50pL，病毒對(duì)照區(qū)各

孔不加(參照?qǐng)D3),

了2-2加被檢血清:以單頭微量移液器精確吸取已作滅活處理的被檢血清，在各排頭兩孔各加入

251,1-。每份被檢血清須平行安排兩排，即每個(gè)稀釋度兩孔。

7.2.3稀釋被檢血清:從第2列開(kāi)始依次向后將被檢血清作倍比稀釋?zhuān)沟?,3,4,5,6列孔的血清稀

釋倍數(shù)依次為2',2',2',2`,2'。稀釋時(shí)，用8頭微量取樣器先在第2列孔內(nèi)吹吸數(shù)次，充分混勻后吸取

25川移入第3列，同前混勻后取25pL移入第4列，以下依次進(jìn)行。當(dāng)?shù)?列各孔混勻后，各吸取25川-

棄去。稀釋過(guò)程中切勿產(chǎn)生氣泡。

7.2.4稀釋對(duì)照血清:同7.2.3法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清稀釋。

7.2.5加病毒液:除血清毒性對(duì)照、病毒對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照外，各孔添加用含20%健康豬新鮮血清E-

MEM營(yíng)養(yǎng)液，將病毒液稀釋成200TCIDso/25pL的工作病毒液25pLo

7.2.6病毒對(duì)照:取滅菌試管4支，用2000健康豬新鮮血清EMEM營(yíng)養(yǎng)液(pH7.2)將病毒液稀釋至

含毒量為200TCIDso/25pL,20TCIDsa/25pL,2TCID5o/25pL和0.2TCID,o/2544個(gè)滴度，然后參

照?qǐng)D3各取25pL加入相應(yīng)的孔內(nèi)(每個(gè)滴度4個(gè)孔)，再于各孔內(nèi)加入25pL2倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)陰性血

清。此時(shí)，病毒濃度分別降為100TCID,,,/25pL,10TCID,,/25pI1TCID,,/25pI和0.1TCID,o/25

t'l

7.2-了中和感作:將培養(yǎng)板放入37-C的5%二氧化碳保濕恒溫箱中感作60min,

GB/T18090--2000

7.2.8添加細(xì)胞:于每孔內(nèi)加入配制好的MARC-145或HS,H細(xì)胞懸液50IA-

7.2.9培養(yǎng):封板后，放入37C的5%二氧化碳保濕恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)

了.3觀察與記錄

在倒置顯微鏡下逐孔觀察致細(xì)胞病變作用(CPE)。每天觀察一次，連續(xù)觀察5夭，并將觀察結(jié)果記

入專(zhuān)用登記表內(nèi)PRRS病毒在MARC-145或HS,H細(xì)胞上生長(zhǎng)，引起的CPE七要是細(xì)胞圓縮、聚集、

固縮，最后溶解脫落

7.4中和效價(jià)計(jì)算和結(jié)果判定

在各對(duì)照組符合下述要求時(shí)，本次中和試驗(yàn)才成立

a)病毒對(duì)照:病毒濃度為。.1TCID,。的各孔不應(yīng)出現(xiàn)任何CPE,100TCID,。的各孔均應(yīng)出現(xiàn)CPE

b)血清毒性對(duì)照:相當(dāng)于試驗(yàn)中最低稀釋度(本標(biāo)準(zhǔn)中為2倍)的被檢血清對(duì)細(xì)胞應(yīng)沒(méi)有任何毒性

作用。

c)細(xì)胞對(duì)照:在整個(gè)試驗(yàn)中應(yīng)一直保持良好的形態(tài)和特征。

d)陽(yáng)性血清對(duì)照:試驗(yàn)中所顯示的能抑制CPE出現(xiàn)的血清最高稀釋度不應(yīng)比其已知滴度差1個(gè)

滴度以上。

e)陰性血清對(duì)照:各稀釋度均應(yīng)出現(xiàn)CPE,

對(duì)被檢血清的中和效價(jià)進(jìn)行計(jì)算。其血清中和效價(jià)為能抑制平行兩孔或兩孔中一孔出現(xiàn)CPE的血

清最高稀釋倍數(shù)的倒數(shù)。血清中和效價(jià)大于或等于1:4，判定為血清中和試驗(yàn)陽(yáng)性，記作SN(+);小于

1:4，判為陰性，記作SN(一)。SN(+)表示被檢豬血清中含有PRRS病毒抗體

8綜合判定

當(dāng)在臨床上懷疑有PRRS病毒感染時(shí)，可根據(jù)實(shí)際情況，由上述五種方法中選用一種或兩種方法

進(jìn)行確診對(duì)于未接種過(guò)PRRS疫苗或已超越疫苗免疫期的豬，經(jīng)任何一種方法檢測(cè)呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，

都可最終判定為PRRS病毒感染豬。對(duì)接種過(guò)PRRS滅活疫苗并在疫苗免疫期內(nèi)的豬，當(dāng)病毒分離鑒

定試驗(yàn)為陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，可終判為PRRS病毒感染豬;當(dāng)僅血清學(xué)試驗(yàn)呈陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，應(yīng)結(jié)合病史和疫苗

接種史進(jìn)行綜合判定，不可一律視為PRRS病毒感染豬。

GB/T18090-2000

附錄A

(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)

血清學(xué)試驗(yàn)中試劑的配制

AlPBS液(0.01mol/LPBS,pH=7.2)用于IFA

氯化鈉(NaCl)

氯化鉀(KCI)

碳酸氫鈉(NaHCO,)

磷酸幾氫鉀(KH,PO,)

三蒸水加至

保存于4C備用。

8g;

0.2g;

1.15g;

0.2g;

1000mL;

A2洗滌液(0.01mol/LPBS-0.05%吐溫-20,PH=7.4)用于IPMA和間接ELISA

磷酸二氫鉀(KH2PO,)0.2g;

磷酸氫幾鈉(Na,HPO,·12H())2.9g;

氯化鈉(NaCl)8.0g;

氯化鉀(KCI)0.2g;

吐溫-200.5mL;

三蒸水加至1000ml-

現(xiàn)用現(xiàn)配。

A3抗原稀釋液CO.05mol/L碳酸鹽緩沖液,pH9.6)用于間接ELISA

碳酸鈉(Na,CO)1.59g;

碳酸氫鈉(NaIICO,)2.93g;

一三蒸水加至1000mL,

4c保存，一周內(nèi)用完。

A4血清稀釋液用于IPMA和ELISA

為含1%犢牛血清的“Al”液。

A5封閉液用于間接ELISA

為含1鮮犢牛血清白蛋白或10%馬血清的“A1"液。

A6顯色/底物溶液用于IPMA

A6.1AEC貯存液

稱(chēng)取氨乙基咔哇(3-amino-

mamide)4ml中，充分溶解后置

A6.2乙酸鈉溶液

乙酸鈉(CH,000Na)

加氣餾水至

用冰乙酸調(diào)整至pH=5.。。

9-ethyl-carbazole,AEC)4mg溶于二甲基甲酞胺(N,N-dimethy-for

40C避光保存

4.15g;

1000ml,

GB/T18090-2000

A6.3乙酸鹽緩沖液

冰乙酸(CHBCOOH)14.8mL;

乙酸鈉溶液35.2mL;

三餾水50.0mL;

充分混勻。

A6.4顯色/底物溶液(AEC-H202)

乙酸鹽緩沖液19mL;

AEC貯存液1ML;

30%過(guò)氧化氫(Hz02)0.067mL;

充分混合后裝于褐色玻璃瓶?jī)?nèi)避光存放?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

A7底物溶液用于間接ELISA

AT1?！?MOO檸檬酸溶液

檸檬酸(C,Ha0)1.92g;

加三餾水至100mL

A7.20.1mol/I磷酸氫二鈉溶液

磷酸氫二鈉(Na,HPO,·12H20)3.589;

加三餾水至100ml_

A7.3底物溶液(TMB-H,O,)

。.1mol/L檸檬酸溶液33.0mL;

。.1mol/L磷酸氫二鈉溶液66.0mL;

四甲基聯(lián)苯胺(TMB)40.0mg;

30%過(guò)氧化氫(HA)1.5mL;

充分混合后裝于褐色玻璃瓶避光存放?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

A8終止液用于間接ELISA

1mol/L氫氟酸(HF)溶液。

附錄B

(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)

豬肺泡巨噬細(xì)胞((PAM)制備、鑒定、保存與復(fù)蘇

B1試劑準(zhǔn)備

B1門(mén)磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)

a)原液甲

氯化鈉(NaCI)8.00g;

氯化鉀(KCU0.20g;

磷酸氫二鈉(Na2HP0,)1.15g;

磷酸二氫鉀(KH2PO,)0.20g.

溶于500ml三餾水中，再加人5mL0.400酚紅液

b)原液乙

112

，加三餾水至800mL,56kPa20min滅菌備用。

GB/T18090-2000

氯化鎂(Mgclz·6H,O)

加三餾水至

0.1g;

100mL

56kPa20min滅菌備用。

c)原液丙

氯化鈣(CaCl,)0.1g

溶于100ml三餾水中，56kPa20min滅菌備用

d)工作液

原液甲8份;

原液乙1份;

原液丙1份。

充分混合后備用。必要時(shí)，可適量加入抗生素(青霉素10'IU/mL,鏈霉素10'vg/ml、慶大霉素

10'Kg/mL)，不加制霉菌素。

B1.2細(xì)胞生長(zhǎng)液

含10%犢牛血清的RPM11640營(yíng)養(yǎng)液(含青霉素100IU/mL,鏈霉素100pg/ml、慶大霉素

50tzg/ml)。

B1.3細(xì)胞凍存液

取細(xì)胞生長(zhǎng)液8.0in[，加人分析純二甲基亞礬(DMSO)2.0mL，混合均勻。不加制霉菌素。

B2PAM的制備

取4-8周齡的SPF豬或被證實(shí)無(wú)PRRS病毒感染的健康豬，動(dòng)脈放血致死后，立即無(wú)菌操作取出

肺，切勿劃破被膜。每次用約200mLPBS液從氣管灌人肺.擠壓灌洗3-4次，收集灌洗液,1000Xg離

,L"10min，得到的巨噬細(xì)胞泥用PBS液再懸浮和離心洗滌2-3次。最后的細(xì)胞泥用50mL細(xì)胞生長(zhǎng)液

懸浮，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用細(xì)胞生長(zhǎng)液稀釋使細(xì)胞濃度達(dá)4X10'/1.5mL。所得新鮮巨噬細(xì)胞立即應(yīng)用或

定量分裝后凍存

B3PAM的凍存

取細(xì)胞濃度為8X10'/1.5mL的細(xì)胞懸液，加入等量細(xì)胞凍存液，緩慢滴加，邊加邊振搖。加畢，立

即用聚苯乙烯管分裝，每管1.5ml，放一70℃過(guò)夜，轉(zhuǎn)人液氮中保存。

液氮保存各批巨噬細(xì)胞，不可混合。

B4PAM的批次試驗(yàn)

侮批巨噬細(xì)胞應(yīng)檢驗(yàn)合格后再使用。方法是，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上用已知滴度的標(biāo)準(zhǔn)病毒感染巨

噬細(xì)胞，并用標(biāo)準(zhǔn)的陽(yáng)性血清和陰性血清進(jìn)行IPMA或IFA測(cè)定。只有能支持特定滴度的標(biāo)準(zhǔn)病毒良

好生長(zhǎng)的巨噬細(xì)胞，方可用于試驗(yàn)。

B5PAM的復(fù)蘇

從液氮中取出冷凍細(xì)胞管，立即投入溫水(38℃左右)中迅速解凍。將細(xì)胞移入10倍量的RP-

MI1640營(yíng)養(yǎng)液(pH=7.2)中，100oxg離心10min，棄去上清液，沉淀的細(xì)胞用細(xì)胞生長(zhǎng)液懸浮，計(jì)數(shù)，

稀釋至要求的細(xì)胞濃度后，即可使用。

B6IPMA診斷板的制備

用細(xì)胞分散液消化Marc-145或HS2H細(xì)胞，用細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液稀釋成5X104細(xì)胞/ml，加人PRRS美

洲或歐洲標(biāo)準(zhǔn)毒使其最終濃度為100TCID,杯25IL,混合后接種96孔細(xì)胞