1、實(shí)驗(yàn)六微生物細(xì)胞的大小測量和顯微計(jì)數(shù),主 講:徐爾尼 生命科學(xué)學(xué)院生物技術(shù)系,一、目的與要求 學(xué)習(xí)測微尺測定微生物細(xì)胞大小，以及血球計(jì)數(shù)板計(jì)算微生物細(xì)胞數(shù)目的原理。 掌握使用測微尺和血球計(jì)數(shù)板對微生物細(xì)胞進(jìn)行大小測量和細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法。 增強(qiáng)微生物細(xì)胞大小的感性認(rèn)識。,二、基本原理 1、微生物細(xì)胞大小的測量 微生物細(xì)胞的大小是微生物基本的形態(tài)特征，也是分類鑒定的依據(jù)之一。微生物大小的測定，需要在顯微鏡下，借助特殊測量工具測微尺（包括鏡臺測微尺和目鏡測微尺）。 測微尺原理：鏡臺測微尺是中央部分刻有精確等分線的載玻片，一般是將1mm等分為100格，每格長0.01mm(即10m)。鏡臺測微尺并不直接用

2、來測量細(xì)胞的大小，而是用于校正目鏡測微尺每格的相對長度，然后再用目鏡測微尺測量微生物細(xì)胞的大小。,二、基本原理 2、顯微直接計(jì)數(shù) 顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上（又稱計(jì)菌器），于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板原理：計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺，中間較寬的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各該有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格多共分為九個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室。,二、基本原理 每個(gè)計(jì)數(shù)室（大方格）邊長為1mm，則每個(gè)大方格的面積為1mm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.1mm，

3、所以計(jì)數(shù)室的容積為0.1mm3（即萬分之一毫升）。 每個(gè)計(jì)數(shù)室有25或16個(gè)中方格。計(jì)數(shù)時(shí)，通常數(shù)五個(gè)中方格的總菌數(shù)，然后求得每個(gè)中方格的平均值，再乘以25或16，就得出一個(gè)大方格的總菌數(shù)，然后換算成1ml菌液中的總菌數(shù)。,三、實(shí)驗(yàn)器材 1、菌種：釀酒酵母菌液、細(xì)菌三形片 2、試劑：無水乙醇、香柏油、二甲苯 3、儀器或其他用具：目鏡測尺、鏡臺測微尺、血球計(jì)數(shù)板、蓋玻片、無菌吸管、酒精燈、顯微鏡、擦鏡紙、濾紙等,四、操作步驟 1、微生物細(xì)胞大小測量 1）目鏡測微尺的校正： 將目鏡測微尺裝入目鏡載物臺上放鏡臺測微尺調(diào)節(jié)粗調(diào)和細(xì)節(jié)調(diào)至直看到鏡臺測微尺的刻度 轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡，推動(dòng)鏡臺測微尺，使兩尺在某一區(qū)域

4、內(nèi)兩線完全重合數(shù)出兩重合線之間鏡臺測微尺和目鏡測微尺所占的格數(shù)根據(jù)兩測微尺重合格數(shù)，計(jì)算出目鏡測微尺每格實(shí)際長度 。 按上述步驟分別校正低倍鏡、高倍鏡和油鏡的下目鏡測尺每小格的實(shí)際長度。,四、操作步驟 2）菌體大小的測量： 取下鏡臺測微尺 將待測標(biāo)本片放在載物臺上 觀察標(biāo)本片中細(xì)胞所占目鏡測微尺的格數(shù) 根據(jù)目鏡測尺的實(shí)際長度算出細(xì)菌的大小 操作要點(diǎn)： 觀察時(shí)光線不宜過強(qiáng)，否則難以找到鏡臺測微尺的刻度。 換高倍鏡和油鏡校正時(shí)，防止接物鏡壓壞鏡臺測微尺和損壞鏡頭。,四、操作步驟 2、顯微直接計(jì)數(shù) 1）血球計(jì)數(shù)室的觀察和清洗 取血球計(jì)數(shù)板置于載物臺上 觀察熟悉計(jì)數(shù)室的中方格和小方格 取下血球計(jì)數(shù)板用

5、自來水沖洗計(jì)數(shù)室后，再用無水乙醇將血球計(jì)數(shù)室沖洗干凈 置干燥箱干燥 。,2）樣品中酵母菌細(xì)胞的直接計(jì)數(shù)： 取干凈血球計(jì)數(shù)板 在計(jì)數(shù)室上方蓋上蓋玻片 用無菌吸管，吸取搖勻的酵母菌稀釋液 在蓋玻片邊緣沾一下，讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)管滲透作用進(jìn)入計(jì)數(shù)室 靜置5min 低倍鏡或高倍鏡計(jì)算每個(gè)中方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù) 完畢后清洗血細(xì)胞計(jì)數(shù)板 沖洗、干燥,計(jì)數(shù)規(guī)則： 1）要求每小格內(nèi)約有510個(gè)菌體為宜； 2）選計(jì)數(shù)室四個(gè)角的中方格和中央的一個(gè)中方格進(jìn)行計(jì)數(shù)； 3）當(dāng)細(xì)胞位于方格的線上時(shí)，一般只數(shù)上方和右邊線上的細(xì)胞； 4）酵母出芽，又未脫離母體的，只有當(dāng)芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時(shí)，即作為兩個(gè)菌體計(jì)算； 操作要點(diǎn)：

6、血球計(jì)數(shù)室要清潔。 觀察時(shí)光線不宜過強(qiáng)，否則難以找到計(jì)數(shù)室。 吸取菌液前菌液要充分搖勻。 血球計(jì)數(shù)室充滿菌液后，要靜置5min。,五、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及處理結(jié)果 1、大小測量 1）將目鏡測微尺校正結(jié)果填入下表： 接目鏡放大倍數(shù)： 2）將各菌測定結(jié)果填入下表,五、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及處理結(jié)果 2、顯微計(jì)數(shù) 將結(jié)果記錄于下表中，A表示五個(gè)中方格的總菌數(shù)，B表示菌液稀釋倍數(shù)。,六、思考與討論 1、根據(jù)你的體會，說明用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的誤差主要來自哪些方面？應(yīng)如何盡量減少誤差、力求準(zhǔn)確？ 2、某單位要求知道一種干酵母粉中的活菌存活率，請?jiān)O(shè)計(jì)1-2種可行的檢測方法。 下次實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目：培養(yǎng)基的配制與高壓蒸汽滅菌,采用目鏡測微尺測量經(jīng)顯微鏡放大后的細(xì)胞物象，由于不同顯微鏡或不同的目鏡和物鏡組合放大倍數(shù)不同，目鏡測微尺每小格所代表的實(shí)際長度也不一樣。因此在測量前要先對目鏡測微尺進(jìn)行校正。,校正公式： 目鏡測微尺每格長度(m)兩重合線間鏡臺測微尺小格數(shù)10/兩重合線間目鏡測微尺小格數(shù),10m,計(jì)數(shù)室,16小方格 25中方格計(jì)數(shù)室,25小方格 16中方格計(jì)數(shù)室,計(jì)數(shù)室的刻度有兩種規(guī)格：,計(jì)算公式： 25個(gè)中方格計(jì)算公式