1、專題2:微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用,課題二、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù),課題背景,1.尿素的利用:尿素CO(NH2)2重要的農(nóng)業(yè)氮肥。只能被土壤中細菌分解為NH3才能被植物吸收利用。,2.細菌利用尿素的原因：,CO(NH2)2+H2O CO2+2NH3,細菌脲酶,課題目標(biāo),1.從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌,2.統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌,尿素分子的立體結(jié)構(gòu),一、研究思路,（一）篩選菌株,1.實例：PCR技術(shù)(DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)) ：一種在體外將少量DNA大量復(fù)制的技術(shù)。此項技術(shù)要求使用耐高溫的DNA聚合酶。,提出的問題如何尋找耐高溫的DNA聚合酶？,解決問題的思路尋找耐高溫環(huán)

2、境。,原因：高溫條件淘汰了絕大多數(shù)微生物。,獲得啟示：尋找目的菌種時要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。,2.實驗室微生物的篩選原理：選擇培養(yǎng)基,人為提供有利于目的菌株生長的特定條件（包括營養(yǎng)、溫度、pH等），同時抑制或阻止其他微生物生長。,課堂探究： 1、伊紅美藍培養(yǎng)基為什么是鑒別培養(yǎng)基而不是選擇培養(yǎng)基？ 2、發(fā)生石油泄漏后，一些微生物可以有效的分解石油，如何配置選擇培養(yǎng)基將這些微生物選擇出來？,二、實驗設(shè)計,土壤取樣,樣品稀釋,土壤微生物大約70%-90%是 ，細菌在酸堿度接近 _ 的潮濕土壤中生長，絕大多數(shù)分布在距地表約38cm的土壤層，因此取樣時一定要鏟 _ 。,細菌,中性

3、,去土表層,所選用的樣品稀釋范圍要保證獲得菌落數(shù)在 之間，適合計數(shù)。 細菌選用： 、 、 倍的稀釋液進行平板培養(yǎng)； 放線菌選用： 、 、 倍的稀釋液進行平板培養(yǎng)； 真菌選用： 、 、 倍的稀釋液進行平板培養(yǎng)；,30-300,一萬,十萬,百萬,一百,一千,一千,一萬,一萬,十萬,制備培養(yǎng)基,微生物培養(yǎng),注：不同的微生物 需要不同的培養(yǎng)溫度和時間,微生物觀察,觀察菌落： 細菌合成的 將尿素分解成 ，使培養(yǎng)基的_ 增強，在以 為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入 _ 指示劑培養(yǎng)細菌，若指示劑變 ，可確定該種細菌是能夠 _ 的微生物，即目的微生物。 計數(shù)菌落： 每隔24h統(tǒng)計 數(shù)一次，最后選取數(shù)目 時的記錄作為結(jié)

4、果，以防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落數(shù)。,脲酶,堿性,尿素,氨,紅,酚紅,分解尿素,菌落,穩(wěn)定,牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為對照，判斷選擇培養(yǎng)基是否起到選擇作用。,選用稀釋倍數(shù)為103107的稀釋液。每個稀釋度下需要3個選擇培養(yǎng)基（平行重復(fù)原則），1個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，共需要制備幾個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和幾個選擇培養(yǎng)基？準(zhǔn)備好無菌試管和移液管,碳源：葡萄糖、尿素,氮源：尿素,能。只有產(chǎn)生脲酶的細菌才能利用尿素作為氮源而生存。,3.選擇培養(yǎng)基,問題3：該培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分別是什么物質(zhì)？,問題4：此配方能否篩選出產(chǎn)生脲酶的細菌？為什么？,在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生

5、物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱做選擇培養(yǎng)基。,加入青霉素的培養(yǎng)基,概念：,細菌不生長，酵母菌、霉菌等真菌能生長。,不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基,分離自養(yǎng)型微生物。,對應(yīng)課堂探究 3和4題,5、兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數(shù)。從對應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果。 1、甲同學(xué)在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)為230。 2、乙同學(xué)在該濃度下涂布了A、B、C三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別為21、212、256，該同學(xué)以這三個平板上菌落數(shù)的平均值163作為統(tǒng)計結(jié)果。你認為這兩位同學(xué)的作法正確嗎？如果有問題，錯在哪？,甲：沒有重復(fù)實驗（至少涂布

6、3個平板）。,乙：A組結(jié)果誤差過大，不應(yīng)用于計算平均值。,一般選擇菌落數(shù)在30300的平板上進行計數(shù)。,稀釋涂布平板法計算注意事項：,學(xué)案預(yù)習(xí)（二）1、2,（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目,2.間接計數(shù)（活菌計數(shù)法）,C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(m)，M代表稀釋倍數(shù)。,當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌，通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。,（2）原理：,稀釋涂布平板法。,（1）常用方法：,計算公式：,每克樣品中的菌落數(shù)(CV)M,【例7】某同學(xué)在稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基上測得平板上的菌落數(shù)的

7、平均值為234，那么每毫升樣品中菌落數(shù)是（涂布平板時所用稀釋液的體積為0.1 mL）（ ） A.2.34108B.2.34109 C.234D.23.4,（3）計數(shù),B,（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目,【解析】稀釋倍數(shù)為106，0.1 mL稀釋液的菌落數(shù)的平均值為234，則每毫升樣品中菌落數(shù)就為234/0.1106=2.34109。,微生物的培養(yǎng)、觀察并記錄結(jié)果,(一)無菌操作,1.取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。,2.應(yīng)在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。,3.在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。,(二）做好標(biāo)記,注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、平板培養(yǎng)樣品的稀釋度等。,（三）規(guī)劃時間,三、操作提示,【課堂小結(jié)】,一、選擇培養(yǎng)基的成分：,分解尿素細菌的分離與計數(shù),尿素作為唯一的氮源。,二、鑒定方法：,在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，若指示劑變紅，pH升高，說明細菌能分解尿素。,三、統(tǒng)計菌落數(shù)目的方法,（1）間接