1、病原細(xì)菌檢驗(yàn)基礎(chǔ)知識(shí),天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 郭立力,一.概念,自然界中有一大類個(gè)體微小的生物，統(tǒng)稱微生物。其中有一小部分對(duì)人或動(dòng)植物有害，也可引起傳染病，這類微生物稱為病原微生物。 細(xì)菌：細(xì)菌是一種單細(xì)胞微生物，個(gè)體微小，需要借用顯微鏡才能觀察到。 非致病菌：無致病性 致病菌：條件性致病菌、非條件性致病菌,1.細(xì)菌的基本形態(tài)及排列 1.1細(xì)菌的形態(tài)：細(xì)菌的外部形態(tài)比較簡單，僅有三種主要類型： 球狀、桿狀、螺旋狀，故將細(xì)菌分為球菌、桿菌和螺旋菌。 1.2 排列方式：細(xì)菌的排列方式是由細(xì)菌的繁殖來決定的。細(xì)菌的繁殖方式就是簡單的裂殖，1變2個(gè)、2個(gè)變4個(gè)。,球菌：多數(shù)球菌為正圓形，根據(jù)分裂方

2、向及分裂后的相連情況又可分為雙球菌、鏈球菌、四聯(lián)球菌、八疊球菌及葡萄球菌。 桿菌：菌體呈桿狀，桿菌的分裂方向只有一個(gè)，故可分為單桿菌、雙桿菌和鏈桿菌。 螺旋菌：菌體呈彎曲或螺旋狀，兩端圓或尖。,2.細(xì)菌的大小 各種細(xì)菌的大小，有一定的差別，長的可達(dá)80微米，短的僅0.2微米。細(xì)菌的大小，以生長在最適宜的溫度和培養(yǎng)基中的年輕培養(yǎng)物為標(biāo)準(zhǔn)的。培養(yǎng)條件、染色方法、制片方法不同，菌體大小也略有差異。,3.細(xì)菌的結(jié)構(gòu) 細(xì)菌細(xì)胞很小，但結(jié)構(gòu)復(fù)雜。 基本結(jié)構(gòu)：細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核 特殊結(jié)構(gòu)：某些細(xì)菌具有特殊的結(jié)構(gòu)，如莢膜、芽孢、鞭毛,二.細(xì)菌的基本檢驗(yàn)技術(shù),1.細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢驗(yàn) 形態(tài)學(xué)檢查技術(shù)是

3、細(xì)菌檢驗(yàn)極為重要的手段之一，它有利于對(duì)細(xì)菌的初步認(rèn)識(shí)，也是決定是否進(jìn)行分離培養(yǎng)及生化反應(yīng)鑒定的重要步驟，有時(shí)可通過形態(tài)學(xué)檢查得到初步診斷，如炭疽等。,1.1染色鏡檢 細(xì)菌是無色、半透明、單細(xì)胞的微小個(gè)體，折光性弱，在顯微鏡下只能看見大致輪廓，給研究細(xì)菌形態(tài)、排列、結(jié)構(gòu)帶來一定困難。為此，用一些染料將細(xì)菌染上不同顏色后，載明視野顯微鏡下就可以觀察到細(xì)菌的內(nèi)部、外部結(jié)構(gòu)及特殊構(gòu)造。,簡單染色法：只用一種染料染色，只能觀察細(xì)菌的形態(tài)，但不能鑒別細(xì)菌； 鑒別染色法：采用兩種以上染料染色，能夠鑒別細(xì)菌和觀察細(xì)菌的特殊構(gòu)造，如革蘭氏染色法、抗酸染色法、特殊染色法。,1.1.1 制片及染片 無論采用哪種染色

4、方法，染色標(biāo)本的制作過程是基本相同的。 抹片：細(xì)菌培養(yǎng)物、體液（膿汁、血液、滲出液）、組織（心、肝、脾）。 干燥：置空氣中自然干燥 固定：將干燥好的片子經(jīng)過加熱或加化學(xué)試劑進(jìn)行固定。固定目的是殺死細(xì)菌，改變其對(duì)染料的通透性，使之容易著色；固定原生質(zhì)及細(xì)胞的其它結(jié)構(gòu)；使細(xì)菌固定在玻片上，染色沖洗時(shí)不易被沖掉。 染色：普通染色、特殊染色,1.1.2注意事項(xiàng) 抹片時(shí)一定要?。?一定要自然干燥，不可用火焰； 火焰固定時(shí)溫度不可過高； 用水沖洗時(shí)，水流不可過大； 使用的載玻片要干凈、無油。1-2%鹽酸浸泡或用酒精棉球擦拭干凈。,1.2直接涂片鏡檢 主要用于檢查細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)力。最常用的有濕片法、懸滴法。 注

5、意事項(xiàng)： 取菌液要適量，不可外溢，不要產(chǎn)生氣泡； 一般不用油鏡； 縮小光圈，下降聚光鏡，造成一個(gè)光線較暗的環(huán)境； 避免環(huán)境污染。,2.細(xì)菌的分離培養(yǎng) 細(xì)菌分離培養(yǎng)是細(xì)菌學(xué)的重要步驟。不同菌類培養(yǎng)所需要的條件及生長特性亦各有差異。有在通常條件下即可生長繁殖的需氧菌和有氧或無氧環(huán)境中都能生長的兼性厭氧菌；也有在無氧環(huán)境中才能生長的厭氧菌；少數(shù)菌尚需培養(yǎng)在適量的二氧化碳環(huán)境中才能生長。細(xì)菌分離培養(yǎng)的方法很多，下面著重介紹常用的幾種方法。,2.1 接種方法 2.1.1平板劃線接種法：平板劃線接種是細(xì)菌分離培養(yǎng)的常用技術(shù)，主要使標(biāo)本或培養(yǎng)物中的混合細(xì)菌能在培養(yǎng)基表面分散生長形成單個(gè)菌落。 連續(xù)劃線分離法

6、：接種環(huán)滅菌后挑取組織或菌液少許呈45度角，在平板1/5處輕輕涂布，然后左右來回以曲線形成劃線接種。 分區(qū)劃線分離法：接種環(huán)于平板內(nèi)分劃五區(qū)，每劃完一個(gè)區(qū)域燒灼環(huán)一次。,2.1.2斜面接種法 保存菌種。 2.1.3穿刺接種法 多用于保存菌種觀察動(dòng)力及做厭氧培養(yǎng)，亦可用于觀察細(xì)菌對(duì)糖類的分解反應(yīng)。 2.1.4傾注平板培養(yǎng)法 細(xì)菌計(jì)數(shù)。,2.2培養(yǎng)方法 2.2.1一般培養(yǎng)法（又稱需氧培養(yǎng)法） 將已接種 好的平板、斜面和液體培養(yǎng)基等，直接置3537孵育箱進(jìn)行培養(yǎng)。 2.2.2二氧化碳培養(yǎng)法 將某些細(xì)菌置于含有CO2環(huán)境中3537進(jìn)行培養(yǎng)。 2.2.3厭氧培養(yǎng)法 厭氧罐法、氣袋法、氣體噴射法 、厭氧培

7、養(yǎng)箱法。,2.3 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基按其形態(tài)有固體、半固體和液體之分。固體培養(yǎng)基又分為平板、斜面和高層。按其用途可分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基、増菌培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基、厭氧培養(yǎng)基。 鮮血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯,3.細(xì)菌的生化鑒定 細(xì)菌在代謝活動(dòng)過程中，進(jìn)行各種生物化學(xué)反應(yīng)，這些反應(yīng)幾乎都靠各種酶系統(tǒng)來催化。不同種類的細(xì)菌所產(chǎn)生的酶類和活性上都有差異，因此在代謝過程產(chǎn)生分解產(chǎn)物和合成產(chǎn)物各不相同。細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)工作中常利用這一特點(diǎn)，以生物化學(xué)方法來鑒別細(xì)菌，稱此為生化試驗(yàn)。此類試驗(yàn)在細(xì)菌的鑒定中極為重要，最常用的生化反應(yīng)試驗(yàn)： 糖發(fā)酵試驗(yàn) V-P試驗(yàn) 甲基紅試驗(yàn) 吲哚試驗(yàn)

8、尿素酶試驗(yàn) 溶血試驗(yàn) 血漿凝固酶試驗(yàn)等,三.藥敏試驗(yàn)基礎(chǔ)知識(shí),細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感試驗(yàn)，通常簡稱為細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)，是在給病畜禽進(jìn)行治療前，測(cè)定細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性，這不僅有助于選擇合適的藥物，而且可提供藥物用量的依據(jù)。某種細(xì)菌對(duì)藥物的敏感度，是指抑制該菌生長所需的最低藥物濃度。細(xì)菌在體外的敏感度和臨床的療效大體上是符合的，但也有不一致者。目前供藥敏試驗(yàn)的方法很多，可歸納為兩大類，即稀釋法和擴(kuò)散法兩種。,1.稀釋法 將所選用的藥物稀釋成不同的濃度，作用于被檢菌株。 試管雙倍稀釋法 固體培養(yǎng)基稀釋法,2.擴(kuò)散法 細(xì)菌藥敏試驗(yàn)的擴(kuò)散法是將抗菌藥物置于已接種待測(cè)菌的固體培養(yǎng)基上（或內(nèi)），抗菌藥物通過向培

9、養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散，抑制敏感菌的生長，從而出現(xiàn)抑菌環(huán)（帶）。由于藥物擴(kuò)散的距離越遠(yuǎn)，達(dá)到該距離的藥物濃度越低，故可根據(jù)抑菌環(huán)的大小，判斷細(xì)菌對(duì)藥物的敏感度。抑菌環(huán)（帶）邊緣的藥物含量即該藥物的敏感度。此法操作簡單，容易掌握，但只用于定性。,2.1紙片法 紙片法就是用含有一定量抗生素的藥敏紙片，貼在已接種試驗(yàn)細(xì)菌的瓊脂平板上，經(jīng)37C培養(yǎng)后，抗生素濃度梯度通過紙片上彌散作用而形成，在敏感抗生素的有效范圍內(nèi)，細(xì)菌的生長受到抑制，在有效范圍之外，細(xì)菌能夠生長，故形成了一個(gè)明星的抑菌環(huán)，根據(jù)是否有抑菌環(huán)及抑菌環(huán)的大小來判定試驗(yàn)菌對(duì)某一抗生素是否敏感及敏感的程度。,2.1.1結(jié)果判定 20mm以上為極敏、15-20mm高敏、10-15mm中敏、10mm低敏、0不敏感 2.1.2注意事項(xiàng) 選用特殊培養(yǎng)基MHA，如果沒有，也可用鮮血瓊脂培養(yǎng)基或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基； 接種菌的濃度不能太高，接種完細(xì)菌后經(jīng)2-3分鐘后，再貼藥敏紙片；培養(yǎng)的溫度要恒定，培養(yǎng)時(shí)間一般為12-24小時(shí)。,2.2挖洞法 挖洞法就是在已接種試驗(yàn)細(xì)菌的瓊脂平板上挖洞