1、蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,核移植技術(shù)與克隆動(dòng)物,基本概念 克隆動(dòng)物的發(fā)展簡(jiǎn)史 胚胎核移植技術(shù) 體細(xì)胞核移植技術(shù) 動(dòng)物克隆技術(shù)的應(yīng)用前景,幾個(gè)基本概念,克隆：是英文clone的音譯，意為生物體通過(guò)細(xì)胞進(jìn)行的無(wú)性繁殖形成的基因型完全相同的后代個(gè)體組成的種群，簡(jiǎn)稱為“無(wú)性繁殖” 英文“Clone”起源于希臘文“Klone”，原意是用“嫩枝”或“插條”繁殖, 核移植：是指利用顯微外科手術(shù)的方法將胚胎細(xì)胞或成體細(xì)胞的細(xì)胞核移人去核的卵母細(xì)胞中，構(gòu)建成重組胚，通過(guò)體內(nèi)或體外培養(yǎng)、胚胎移植，產(chǎn)生與供體細(xì)胞基因型相同的后代的技術(shù)過(guò)程，又稱為動(dòng)物克隆技術(shù) 根據(jù)核供體的來(lái)源不同，可將其分為胚胎細(xì)胞核移植和體細(xì)胞核移植

2、通常所說(shuō)的動(dòng)物克隆指體細(xì)胞克隆，即動(dòng)物的無(wú)性繁殖, 動(dòng)物克隆：是一種通過(guò)核移植過(guò)程進(jìn)行無(wú)性繁殖的技術(shù)。發(fā)育早期的動(dòng)物胚胎細(xì)胞，或成年動(dòng)物的體細(xì)胞，經(jīng)顯微手術(shù)移植到去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中之后，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新發(fā)育成正常胚胎，移植到生殖周期相近的母體之中，可以發(fā)育成為正常動(dòng)物個(gè)體。經(jīng)過(guò)核移植而產(chǎn)生的動(dòng)物，其遺傳結(jié)構(gòu)與細(xì)胞核供體完全相同 克隆動(dòng)物：不經(jīng)過(guò)有性生殖過(guò)程，而是通過(guò)核移植生產(chǎn)的遺傳結(jié)構(gòu)與細(xì)胞核供體相同動(dòng)物個(gè)體，就叫做克隆動(dòng)物, 胚胎克?。菏褂玫暮斯w細(xì)胞如果來(lái)自多細(xì)胞階段的胚胎，叫做胚胎克隆 體細(xì)胞克?。菏褂玫暮斯w細(xì)胞來(lái)自動(dòng)物體細(xì)胞，叫做體細(xì)胞克隆,動(dòng)物克隆大事記,1938年，德

3、國(guó)科學(xué)家Hans Spemann建議用成年的細(xì)胞核植卵子的方法進(jìn)行哺乳動(dòng)物克隆 1952年，英國(guó)的Briggs和King開始克隆青蛙，雖未能成功，但開始尋找克隆技術(shù) 1962年，英國(guó)劍橋大學(xué)的Gurdon宣布他用1個(gè)成年蛙細(xì)胞克隆出1只蝌蚪，從而引發(fā)了關(guān)于克隆的第一輪辯論 1965年，中國(guó)實(shí)驗(yàn)胚胎學(xué)家童第周完成了金魚核移植并獲得成功,動(dòng)物克隆大事記,1983年，美國(guó)科學(xué)家Mcgrath和Solter克隆出小鼠 1984年，丹麥科學(xué)家Willadsen用胚胎細(xì)胞克隆出1只羊，這是第一例得到證實(shí)的通過(guò)胚胎核移植技術(shù)克隆出的哺乳動(dòng)物 1993年，美國(guó)的First用牛胚團(tuán)細(xì)胞成功獲得克隆牛 1996年

4、，英國(guó)人Ian Wilmut成功獲得體細(xì)胞克隆羊“多利”，這是世界上第一例利用成年體細(xì)胞核移植獲得的克隆動(dòng)物,1997年，中國(guó)學(xué)者孟勵(lì)在美國(guó)用胚胎細(xì)胞克隆猴獲得成功 1998年，日本科學(xué)家Kato等用牛的輸卵管細(xì)胞得到克隆牛 1998年，美國(guó)人Yanagimachi領(lǐng)導(dǎo)的研究小組用克隆鼠的卵丘細(xì)胞核作供體，獲得了克隆再克隆小鼠 1998年，一個(gè)多國(guó)聯(lián)合科學(xué)小組用1個(gè)人的腿部體細(xì)胞與1個(gè)奶牛的卵細(xì)胞結(jié)合，成功克隆了1個(gè)人的胚胎，但只“生活”發(fā)育了12d就被有意毀掉 1998年1999年，美國(guó)人White用珍稀動(dòng)物盤羊的體細(xì)胞核與牛卵結(jié)合；韓國(guó)的黃禹錫將白頭山老虎體細(xì)胞核與牛卵結(jié)合；我國(guó)學(xué)者陳大元

5、將大熊貓?bào)w細(xì)胞核與兔卵結(jié)合，均成功克隆出早期胚胎（異種克?。?2000年，美籍華裔學(xué)者楊向中領(lǐng)導(dǎo)的研究小組利用17歲公牛耳部皮膚的成纖維細(xì)胞成功獲得克隆牛, 2000年，美國(guó)科學(xué)家成功地克隆出首例靈長(zhǎng)類動(dòng)物一只恒河短尾猴“泰特拉（Tetra）”。與其它動(dòng)物克隆不同的是，“泰特拉”未用細(xì)胞核移植技術(shù)，而是采用胚胎分解的方法，將受精卵培育卵裂至8個(gè)細(xì)胞時(shí)將其分離，每2個(gè)細(xì)胞分為一部分，共分為4部分，并分別植入4個(gè)“代理母親”子宮中，結(jié)果有一個(gè)“代理母親”成功生下了“泰特拉”，這意味著克隆人類已沒(méi)有技術(shù)障礙 2000年6月22日，我國(guó)生物胚胎專家張涌在西北農(nóng)林科技大學(xué)種羊場(chǎng)順利接生了1只雌性體細(xì)胞克

6、隆山羊“陽(yáng)陽(yáng)”。“陽(yáng)陽(yáng)”經(jīng)自然受孕后，并于2001年8月8日產(chǎn)下一對(duì)混血兒女，雄性叫“歡歡”，雌性叫“慶慶”，都是體細(xì)胞克隆山羊“陽(yáng)陽(yáng)”與世界首批胚胎克隆山羊交配的后代。“陽(yáng)陽(yáng)”的生產(chǎn)可以證明體細(xì)胞克隆山羊和胚胎克隆山羊具有與普通山羊一樣的生育繁殖能力 2001年，美、意科學(xué)家聯(lián)手展開克隆人的工作，但遭到國(guó)際社會(huì)的普遍反對(duì) 2001年，美國(guó)宣布首次克隆成功處于早期階段的人體胚胎,世界上首例克隆馬“普羅梅泰亞”（意大利） 后面是它的“母親兼姐姐”,世界上第一頭克隆騾子（美國(guó)）,世界第一只克隆貓,基因母親,代理母親,克隆兔,克隆鼠庫(kù)姆利納,克隆猴特拉,克隆牛（日本）,克隆狗史努比,克隆豬,上海轉(zhuǎn)基

7、因羊,克隆山羊“陽(yáng)陽(yáng)”,克隆?！翱瓶啤?中國(guó)克隆兔,“克隆魚”,多莉,雙尾金魚,單尾金魚,克隆鹿杜威,克隆人胚胎,細(xì)胞核移植技術(shù)的基本過(guò)程,核受體和核供體的處理和制備 核移植 重組胚的體外或體內(nèi)培養(yǎng) 核移植胚胎移入代孕母畜（寄母） 克隆個(gè)體的孕育,胚胎細(xì)胞核移植技術(shù)（胚胎細(xì)胞克隆）,1 核受體細(xì)胞的準(zhǔn)備 去核卵母細(xì)胞常常作為核移植的受體細(xì)胞。這是因?yàn)樵诼涯讣?xì)胞的細(xì)胞質(zhì)含有某種特定的因子，可以使移植核中所含有的基因表達(dá)程序發(fā)生重新排列，使已經(jīng)分化了的細(xì)胞重新回到發(fā)育過(guò)程的原點(diǎn)，同受精卵一樣開始個(gè)體發(fā)育過(guò)程 卵母細(xì)胞的來(lái)源有兩種方式： 用激素對(duì)雌體進(jìn)行超排處理，從輸卵管沖出體內(nèi)成熟的M卵母細(xì)胞。

8、從屠宰場(chǎng)收集卵巢，吸出濾泡中的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，在體外培養(yǎng)成熟后作為受體,2 核供體細(xì)胞的準(zhǔn)備 核移植操作中，細(xì)胞核供體細(xì)胞首先必須是完整的二倍體，該細(xì)胞必須保持有供體動(dòng)物完整的基因組 供體細(xì)胞核必須能夠在受體細(xì)胞質(zhì)的作用下，產(chǎn)生細(xì)胞分化過(guò)程的倒轉(zhuǎn)，變得如同剛剛受精的合子一樣，能重新完成從受精到發(fā)育成一個(gè)正常動(dòng)物個(gè)體的全過(guò)程 核供體細(xì)胞主要有胚胎卵裂球、胚胎干細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞,8細(xì)胞胚胎分離,3 細(xì)胞核移植 常用的核移植方法有兩種 胞質(zhì)內(nèi)注射：用一個(gè)外徑5-8m 的注核針吸取供體核后直接注射進(jìn)卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的方法 透明帶下注射：供體細(xì)胞核注射在透明帶與卵母細(xì)胞之間的卵周隙中，

9、核移植后用電刺激進(jìn)行細(xì)胞融合,胚胎細(xì)胞注射入去核卵母細(xì)胞透明帶中,4 激 活 卵母細(xì)胞的激活涉及的因素很多，無(wú)論是受精引起的卵母細(xì)胞激活還是人工的激活，都會(huì)引起卵母細(xì)胞發(fā)生一系列的反應(yīng)，這些反應(yīng)是胚胎發(fā)育所必需的 激活原理是通過(guò)電刺激、鈣離子載體等方法，使卵母細(xì)胞從MII期中解放出來(lái)，并轉(zhuǎn)到“受精”的狀態(tài),5重組胚的體內(nèi)或體外培養(yǎng) 經(jīng)融合和激活的重組胚移入中間受體進(jìn)行體內(nèi)或體外培養(yǎng)，觀察重組胚的發(fā)育率 羊、牛、豬的核移植胚常采用體內(nèi)培養(yǎng)方法獲得桑椹胚和囊胚，即羊和牛的重組胚用瓊脂包埋后移入休情期的母羊結(jié)扎的輸卵管中體內(nèi)培養(yǎng)4-7d，發(fā)育至桑椹胚和囊胚 豬的核移植重組胚移入同期化受體母豬輸卵管內(nèi)

10、作體內(nèi)培養(yǎng)7d，發(fā)育為囊胚 大鼠、小鼠和兔的核移植胚多作體外培養(yǎng)，發(fā)育至桑椹胚或囊胚,6 胚胎移植 克隆胚胎移植的受體母體要選擇皮毛顏色與供體品種不同、繁殖性能強(qiáng)、體格稍大的當(dāng)?shù)仄贩N，進(jìn)行同期發(fā)情處理，按常規(guī)方法移植代孕母（寄母）的子宮 發(fā)育、產(chǎn)仔,1958年到1962年，英國(guó)劍橋大學(xué)的John Gurdon和Machineer利用爪蟾原腸內(nèi)胚層細(xì)胞核移植，培育出可育的非洲爪蟾,1989年，童第周、牛滿江將鯽魚胚胎細(xì)胞核移入鯉魚去核的未受精卵中，實(shí)現(xiàn)了不同種間的核質(zhì)雜交，成功地?zé)o性繁殖了“鯉鯽核魚”新品種,1981年，瑞士日內(nèi)瓦大學(xué)和美國(guó)杰克遜實(shí)驗(yàn)室合作，首次對(duì)小鼠卵進(jìn)行移核試驗(yàn)獲得成功,體細(xì)

11、胞核移植技術(shù)（體細(xì)胞克隆）,細(xì)胞的發(fā)育潛能,由一個(gè)細(xì)胞可能分化發(fā)育出多少種細(xì)胞？這就是細(xì)胞的發(fā)育潛能 全能性：具有能使后代細(xì)胞形成完整個(gè)體的潛能的細(xì)胞稱全能性細(xì)胞（受精卵） 多能性：具有分化出多種組織或細(xì)胞（但是不能形成完整個(gè)體）的潛能的細(xì)胞稱多能性細(xì)胞（多能干細(xì)胞） 單能性：只能分化成一種細(xì)胞的干細(xì)胞稱單能干細(xì)胞 （單能/定向干細(xì)胞）,所有體細(xì)胞核均保持著全套基因組 對(duì)于植物來(lái)說(shuō)，分化成熟的植物細(xì)胞體，仍保持全能性，仍有可能發(fā)育成完整植株 對(duì)于動(dòng)物來(lái)說(shuō)，隨著分化的演進(jìn)，細(xì)胞逐漸喪失其分化潛能（全能性 多能性 單能性 分化成熟的體細(xì)胞） 分化成熟的動(dòng)物細(xì)胞已失去全能性，不可能發(fā)育成完整的動(dòng)物個(gè)

12、體, 胚胎克隆實(shí)驗(yàn)證實(shí)：囊胚階段的胚胎細(xì)胞，其細(xì)胞核仍具有全能性，可能發(fā)育成完整個(gè)體 細(xì)胞質(zhì)中有著決定細(xì)胞分化全能性的物質(zhì)，稱為分化決定子，可能是 RNA 在卵子形成過(guò)程中，卵母細(xì)胞中含有 25 萬(wàn)種 mRNA，每種約 600個(gè)拷貝。這些 RNA 構(gòu)成母體信息，決定受精卵的發(fā)育潛能 體細(xì)胞核中含全套基因組，在卵細(xì)胞質(zhì)中有可能恢復(fù)全能性,體細(xì)胞核移植技術(shù)的方法,體細(xì)胞核移植技術(shù)類似于胚胎核移植技術(shù)，但技術(shù)難度、意義和應(yīng)用價(jià)值相距甚遠(yuǎn) 基本原理：體外通過(guò)物理的或化學(xué)的方法激活體細(xì)胞核基因組，使之恢復(fù)到全能狀態(tài)，然后植入去核卵細(xì)胞中，組裝成“類卵細(xì)胞”，植入代孕母體發(fā)育成新個(gè)體 體細(xì)胞克隆的具體過(guò)程

13、（以多利羊?yàn)槔?第一步 取妊娠期的6歲母綿羊（Finn Dorset白色母羊）的乳腺細(xì)胞作核供體細(xì)胞，用饑餓法使其進(jìn)入休眠狀態(tài)而使全部基因具有活性 第二步 注射促性腺激素，促使母羊（Sottish Blackface黑面母綿羊）排卵，2833小時(shí)取其未受精卵，快速去核，放入10%FCS、1%FCS和0.5%FCS連續(xù)5天，使其進(jìn)入G0期做受體細(xì)胞,第三步 乳腺細(xì)胞與無(wú)核卵放入同一培養(yǎng)皿中，在微電流的作用下，將乳腺細(xì)胞融入卵中，形成一個(gè)含有新的遺傳物質(zhì)的卵細(xì)胞 第四步 新的卵細(xì)胞植入羊的結(jié)扎的輸卵管內(nèi)，6天后發(fā)育為桑椹胚或囊胚（8-16個(gè)細(xì)胞） 第五步 將此早期胚胎移入假孕母羊（黑面）子宮中，

14、產(chǎn)下多利即為6歲母羊的復(fù)制品，也為白色,為何是突破性的工作：,第一，解決了使供體細(xì)胞與核受體細(xì)胞（去核卵細(xì)胞）同步的方法。 第二，解決了用體細(xì)胞做核供體與轉(zhuǎn)基因的問(wèn)題。,多利羊?qū)嶒?yàn)的理論意義,證實(shí)分化成熟的動(dòng)物細(xì)胞核仍具全能性 證實(shí)細(xì)胞質(zhì)對(duì)胚胎發(fā)育分化的決定性,異種克隆,克隆大熊貓 盡管大熊貓人工繁殖技術(shù)一次又 一次改進(jìn)和提高,也有新的突破。但用有性繁殖的方法,增加數(shù)量 仍然有限,何況目前總的來(lái)看,死亡多于新生的,因此無(wú)法從根本上解決大熊貓瀕臨滅 絕的嚴(yán)峻問(wèn)題 中國(guó)克隆大熊貓技術(shù)的三個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題，包括異種核質(zhì)相容、囊胚著床和克隆個(gè)體三個(gè)階段，前兩個(gè)階段的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)已成功。克隆大熊貓的關(guān)鍵問(wèn)題則是第三

15、步，即大熊貓的胚胎能否在家貓或其他寄母的子宮中形成個(gè)體,請(qǐng)問(wèn)：我們能被克隆嗎？,我們正在努力！,克隆人和治療性克隆,證明人體單個(gè)細(xì)胞的遺傳物質(zhì)能被誘導(dǎo)發(fā)育成為幼胚胎；不可能通過(guò)克隆得到完全相同的成年人 目前克隆技術(shù)尚不成熟 任何克隆動(dòng)物都有基因上的缺陷 克隆牛、羊、豬、鼠都存在體形過(guò)度龐大、發(fā)育不良、免疫系統(tǒng) 缺陷和心肺功能不健全的問(wèn)題,人類胚胎干細(xì)胞研究和治療性克隆,在體細(xì)胞克隆技術(shù)出現(xiàn)之前，科學(xué)家只能通過(guò)流產(chǎn)、死產(chǎn)或人工授精的人類胚胎獲取胚胎干細(xì)胞進(jìn)行研究 克隆羊多利的問(wèn)世，意味著人們可以通過(guò)體細(xì)胞克隆出人類胚胎，這將使獲取干細(xì)胞更為容易 醫(yī)生可以取病人體細(xì)胞進(jìn)行克隆，從中提取干細(xì)胞，培育

16、出遺傳特征與病人完全吻合的細(xì)胞、組織或器官，如果向提供細(xì)胞的病人移植這些組織器官，這就是所謂“治療性克隆”,如果治療性克隆研究取得成功，病人將可以輕易地獲得與自己完全合適的移植器官，不會(huì)產(chǎn)生排異反應(yīng) 造血細(xì)胞、腦細(xì)胞、骨骼和內(nèi)臟器官等都將可以更換 白血病、帕金森氏癥、心臟病和癌癥等疾病的患者帶來(lái)生的希望,體細(xì)胞克隆技術(shù)應(yīng)用于人類疾病的治療,細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景,1 加速家畜遺傳改良進(jìn)程，促進(jìn)優(yōu)良畜群繁育 2 保護(hù)瀕危物種，增加存活數(shù)量 3 克?。◤?fù)制）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)醫(yī)用蛋白類藥物 4 克隆轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以作為異種移植的供體，可以用于組織器官的移植,5 對(duì)克隆動(dòng)物的研究可使人們更深入地了解胚胎發(fā)育及衰老過(guò)程 6 利用克隆動(dòng)物做疾病模型，可使人們更好地追蹤研究疾病的發(fā)展過(guò)程和治療疾病 7 人的核移植胚胎干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化，形成相應(yīng)的組織、器官后，可用于組織器官的移植 8 動(dòng)物育種：克隆技術(shù)用于動(dòng)物育種可以極大地加快育種的速度,克隆技術(shù)存在的問(wèn)題,理論問(wèn)題