1、Feulgen-Rossenbeck改良的DNA法,脫氧核糖核酸通過(guò)鹽酸水解，第一步從DNA的脫氧核糖核酸殘基分解出堿基，第二步在脫氧核糖殘基的第14位碳鍵處打斷糖苷鍵而游離出醛基，游離出來(lái)的醛基即與無(wú)色復(fù)紅液（Schiff試劑）反應(yīng)形成紫紅色的復(fù)合物而把DNA顯示出來(lái)。Schiff試劑配制 同PAS反應(yīng),作用原理,操 作 步 驟,結(jié)果 DNA呈紫紅色，胞質(zhì)呈淺綠色。 注意事項(xiàng) 新鮮組織染色效果較好。 以Carnoy液固定的組織染色效果較好。 最佳水解時(shí)間隨所用固定方法而異。如用無(wú)水乙醇固定，水解時(shí)間為5min，如用Carnoy液固定則水解時(shí)間為8min。 在配制Schiff試劑時(shí)，要求活性炭

2、質(zhì)優(yōu)而量少，每100mlSchiff試劑應(yīng)少于300mg，接觸時(shí)間不得超過(guò)2min，以免被SO2漂白；用布氏漏斗、粗濾紙或玻璃絲快速過(guò)濾。, 1NHCl應(yīng)預(yù)熱到60。 有些堿性復(fù)紅含雜質(zhì)太多，亞硫酸氫鹽不能使復(fù)紅脫色，不能用于配制Schiff試劑。 偏重亞硫酸鹽如保管不佳，潮解或硫味不足，則不能使復(fù)紅脫色。 盛Schiff試劑的瓶子不宜過(guò)大，避免SO2逸出而留在瓶?jī)?nèi)無(wú)液體的空間。 要特別注意Schiff試劑貯存過(guò)程中SO2的喪失及試劑PH值改變。染色深度（及其分光性質(zhì)）嚴(yán)格取決于所用試劑的PH值。,過(guò)碘酸-Schiff反應(yīng),作用原理 糖原、多糖和糖蛋白等都可用過(guò)碘酸-Schiff反應(yīng)（PAS反

3、應(yīng)）來(lái)顯示。其原理是通過(guò)過(guò)碘酸的氧化作用，將糖分子中的碳鍵打斷，游離出醛基，與無(wú)色堿性品紅反應(yīng)顯示出紅色。 試劑配制 過(guò)碘酸氧化液 高碘酸0.5g，蒸餾水100ml。此液溶后冰箱中待用。 Schiff液 堿性復(fù)紅 1g 1N鹽酸 20ml 偏重亞硫酸鈉 1g 雙蒸餾水 200ml 先將200ml雙蒸餾水煮沸，稍有火焰，加入1g堿性復(fù)紅，再煮沸1min。冷卻至50加入20ml1N鹽酸，待35時(shí)加入2g偏重亞硫酸鈉。室溫中2h之后見(jiàn)稍帶紅色，5h之后變?yōu)闊o(wú)色液體。棕色瓶?jī)?nèi)裝好，封口，放入冰箱中保存待用。,染色過(guò)程 組織切片，脫蠟至水； 蒸餾水洗； 入過(guò)碘酸氧化液1020min； 充分蒸餾水洗； S

4、chiff液染色10min（如果室溫在15以下可稍加溫以加快反應(yīng)）； 流水沖洗10min（對(duì)著色較深顏色的切片可縮短時(shí)間）。 可用Mayer明礬蘇木素液染核35min； 0.5%鹽酸乙醇分化； 無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。,結(jié)果 PAS反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物呈紅色，細(xì)胞核藍(lán)色。 注意事項(xiàng) 為避免多糖類(lèi)物質(zhì)溶解，不用水溶性固定劑。對(duì)于糖原的 固定，則需選用Carnoy等固定液。 偏重亞硫酸鈉需質(zhì)量?jī)?yōu)良，不能使用陳舊無(wú)硫的刺激性氣 味的藥品。 染了Schiff液后，不可用自來(lái)水沖洗過(guò)久，防止返紅。應(yīng) 注意切片變紅適中后立即封片。,Feulgen 反應(yīng)顯示脫氧核糖核酸 （1）原理；脫氧核糖核酸經(jīng)1

5、N鹽酸在60水解，破壞嘌呤和脫氧核糖之間的配糖鍵而形成醛基，再與無(wú)色的Schiff試劑結(jié)合使其還原，形成具有醌結(jié)構(gòu)的紅紫色化合物即脫氧核糖核酸（DNA）。 （2）操作步驟： 1)取23毫米厚的組織塊，固定于Carnoy或10% 甲醛等液均可。 2)石蠟切片、脫蠟至水。 3)入1N鹽酸60 60分鐘水解。 1N鹽酸的配制：用比重1.19濃鹽酸82.5毫升，加蒸餾水到1000毫升即成。 鹽酸水解的時(shí)間，隨所用的固定劑不同而別。（見(jiàn)Bauer表） 4)蒸餾水洗。 5)入Schiff氏試劑中反應(yīng)30分鐘至1小時(shí)。 取0.5克堿性品紅（Basic uchsin）溶于100毫升煮沸的蒸餾水（用三角燒瓶）時(shí)

6、時(shí)搖蕩，煮5分鐘，使之充分溶解。冷至50時(shí)過(guò)濾加10毫升1N鹽酸。冷至25時(shí)加0.5克偏重亞硫酸鈉或鉀或無(wú)水亞硫酸氫鈉，放入棕色瓶于暗處?kù)o放24小時(shí)，有時(shí)需23天，應(yīng)由紫紅色變?yōu)榈S色，置于暗處，密封瓶口，冰箱內(nèi)可保存數(shù)月。若24小時(shí)后顏色過(guò)深可加活性炭0.5克搖勻脫色1分鐘，用粗紙濾過(guò)保存。 6)切片用自來(lái)水洗，洗去多余的染液。沖洗前切片呈淡紅色，沖洗后顏色可以加深。 7)脫水、透明、樹(shù)膠封片。 （3）結(jié)果：DNA呈紫紅色。,（4）注意事項(xiàng) 1) 新鮮組織染色效果較好。 2) 以Carnoy液固定的組織染色效果較好。 3) 最佳水解時(shí)間隨所用固定方法而異。如用無(wú)水乙醇固定，水解時(shí)間為5min

7、，如用Carnoy液固定則水解時(shí)間為8min。 4) 在配制Schiff試劑時(shí)，要求活性炭質(zhì)優(yōu)而量少，每100mlSchiff試劑應(yīng)少于300mg，接觸時(shí)間不得超過(guò)2min，以免被SO2漂白；用布氏漏斗、粗濾紙或玻璃絲快速過(guò)濾。 5)1NHCl應(yīng)預(yù)熱到60。 6) 有些堿性復(fù)紅含雜質(zhì)太多，亞硫酸氫鹽不能使復(fù)紅脫色，不能用于配制Schiff試劑。 7) 偏重亞硫酸鹽如保管不佳，潮解或硫味不足，則不能使復(fù)紅脫色。 8) 盛Schiff試劑的瓶子不宜過(guò)大，避免SO2逸出而留在瓶?jī)?nèi)無(wú)液體的空間。 9) 要特別注意Schiff試劑貯存過(guò)程中SO2的喪失及試劑PH值改變。染色深度（及其分光性質(zhì)）嚴(yán)格取決于

8、所用試劑的PH值。,過(guò)碘酸-Schiff反應(yīng)顯示糖類(lèi) 作用原理 糖原、多糖和糖蛋白等都可用過(guò)碘酸-Schiff反應(yīng)（PAS反應(yīng)）來(lái)顯示。其原理是通過(guò)過(guò)碘酸的氧化作用，將糖分子中的碳鍵打斷，游離出醛基，與無(wú)色堿性品紅反應(yīng)顯示出紅色。 試劑配制 過(guò)碘酸氧化液 高碘酸0.5g，蒸餾水100ml。此液溶后冰箱中待用。 Schiff液 堿性復(fù)紅 1g 1N鹽酸 20ml 偏重亞硫酸鈉 1g 雙蒸餾水 200ml 先將200ml雙蒸餾水煮沸，稍有火焰，加入1g堿性復(fù)紅，再煮沸1min。冷卻至50加入20ml1N鹽酸，待35時(shí)加入2g偏重亞硫酸鈉。室溫中2h之后見(jiàn)稍帶紅色，5h之后變?yōu)闊o(wú)色液體。棕色瓶?jī)?nèi)裝好

9、，封口，放入冰箱中保存待用。 染色過(guò)程 組織切片，脫蠟至水； 蒸餾水洗； 入過(guò)碘酸氧化液1020min； 充分蒸餾水洗； Schiff液染色30min（如果室溫在15以下可稍加溫以加快反應(yīng)）； 流水沖洗10min（對(duì)著色較深顏色的切片可縮短時(shí)間）。 0.5%鹽酸乙醇分化； 無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。 結(jié)果 PAS反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物呈紅色。,汞-溴酚籃法顯示蛋白質(zhì) 1) 固定與切片 10福爾馬林等各種固定劑均可（避免用鋨酸液固定），石蠟切片。 2) 切片按常規(guī)脫蠟，經(jīng)下行酒精入水。 3) 用汞-溴酚籃液染色15分鐘至2小時(shí)。 4) 0.5%醋酸水溶液換洗3次，各5分鐘。 5) 直接入叔丁

10、醇（Tertiary-butylalcohol）1分鐘。 6) 再在叔丁醇內(nèi)換23次，共3小時(shí)或過(guò)夜。 7) 二甲苯透明，封片。 結(jié)果：所有蛋白質(zhì)均染成灰藍(lán)色。 （2）堅(jiān)牢綠法顯示堿性蛋白質(zhì) 1) 10%中性緩沖福爾馬林液固定36小時(shí)，石蠟切片。 2) 切片下行入水，流水沖洗0.52小時(shí)。 3) 新配5%三氯醋酸（Trichloroacetic acid, TCA）盛于染色缸，在沸水浴升溫后15-20分鐘。 4) 在冷5%三氯醋酸漂洗，再換蒸餾水洗3次，每次5分鐘。 5) 堅(jiān)牢綠染液內(nèi)，室溫染色30分鐘。 1堅(jiān)牢綠（Fast green FCF） 10ml 0.005M磷酸二氫鈉（NaH2PO

11、4H2O）緩沖液，調(diào)pH8.08.1 90ml 6) 蒸餾水漂洗。濾紙沾干后直入95酒精25分鐘。 7) 換無(wú)水酒精2次，每次5分鐘，二甲苯透明，合成樹(shù)脂封片。 結(jié)果：堿性蛋白質(zhì)呈藍(lán)綠色。,蘇丹法顯示脂肪 （1）取新鮮組織于10%甲醛固定，冰凍切片； （2）經(jīng)50%酒精數(shù)分鐘； （3）入蘇丹染色液中1530分鐘（放置56600C溫箱中）， 蘇丹0.20.3 g溶于70%酒精100 ml，放置600C溫箱中1小時(shí)，冷后過(guò)濾，用時(shí)取20 ml加蒸餾水23 ml； 50%70%酒精洗片刻，蒸餾水洗； Hansen氏蘇木精染細(xì)胞核，水洗； 純甘油透明，濕性封片。 結(jié)果：脂肪呈深桔黃色，細(xì)胞核藍(lán)色，膽脂

12、素呈淡紅色，脂肪酸不染色。 此方法為最常用的脂肪染色法，對(duì)各種組織均適用。,涂片法（吉姆薩染色） （觀察血細(xì)胞） 1試劑配制 Wright染液的配置： Wright粉劑 0.1g 甲醇 60ml 將粉劑置于碾缽內(nèi)，充分研磨，越細(xì)越好。將甲醇逐步加入碾缽內(nèi)，邊加邊碾直至粉劑全部溶解。置于試劑瓶?jī)?nèi)密封保存，一周后可用，一月后效果最佳。 磷酸鹽緩沖液（pH7）： 0.2M磷酸二氫鈉(acid sodium phosphate) 19.5ml 0.2M磷酸氫二鈉(disodium phosphate) 30.5ml 蒸餾水 50ml。 2染色程序 將涂好的血片，用蠟塊劃出染色區(qū)，以防染液溢流； 將涂好的血片平放在桌上，滴加Wright染液至恰好布滿所劃范圍內(nèi)的血膜，染色約2min； 加入等量的磷酸鹽緩沖液（pH7）或蒸餾水，染色約3min，傾去涂片上的染液，以蒸餾水沖洗，待洗凈染液至血膜呈淡紅色