1、.8.3 PCR放大未知的DNA片段。獲得DNA后，要獲得旁邊未知的DNA片段，可以通過染色體階段檢查來完成。染色體補查是指從生物基因組或基因組文庫的已知序列中逐步獲得或檢測與旁邊的未知序列或已知序列建立線性關(guān)系的目的序列的核苷酸構(gòu)成的方法和過程。(約翰f肯尼迪、美國電視電視劇(Northern Exposure)、染色體)、8.3.1反向PCR和反向PCR(inverse PCR)是在圖8-8中所示的已知序列周圍放大未知序列的簡單方法首先用已知片段內(nèi)部不存在的限制性內(nèi)切酶切割模板DNA，然后將酶切的DNA片段連接成環(huán)狀分子。其中至少有一個環(huán)狀分子包含已知的整個片段。根據(jù)已知段兩端的“序列設(shè)計

2、引物”(Sequence Design Foundation)，可以放大相鄰DNA片段。圖8-8反向PCR原理圖表，8.3.2利用連接器的PCR。這種方法的第一階段通?？梢詫⒒蚪MDNA切割成限制內(nèi)切酶，然后擴展根據(jù)PCR所需的另一端的引物提供已知序列設(shè)計的引物和連接器序列設(shè)計的引物、已知序列翼的未知序列。，(約翰f肯尼迪、美國電視電視劇(Northern Exposure，Northern Exposure，酶)PCR放大引物是根據(jù)連接器拉伸端序列設(shè)計的引物L(fēng)P1和LP2，以及根據(jù)已知序列設(shè)計的引物SP1和SP2。8.3.3列不對稱交錯PCR，Tail-PCR : Thermal Asymm

3、etric Interlaced PCR使用不同退火溫度選擇性放大目標(biāo)段。采用特異性引物和隨機引物PCR的PCR一般是特異性引物和簡要引物擴增的產(chǎn)物(同特異性引物擴增的產(chǎn)物(II型產(chǎn)物)；相同退化引物擴增的產(chǎn)物(III型產(chǎn)物)。TAIL-PCR的基本原則是使用目標(biāo)序列旁邊的已知序列設(shè)計三個嵌套的奇點引物(SP1、SP2、SP3，約為14bp)，并且每個都具有低Tm值的短隨機簡單性和引物(；脫PCR共分為3次反應(yīng)。TAIL-PCR是特殊的熱循環(huán)程序，有利于PCR反應(yīng)的產(chǎn)物放大，是抑制型非特異性產(chǎn)物。使用長的高退火溫度的嵌套特定引物和短的低退火溫度的隨機減少和引物，退火溫度差異很大。通過控制退火溫度，控制某種引物優(yōu)勢，可以控制產(chǎn)物的放大。首先進行第五輪高度的嚴(yán)格擴增，這主要是由于異性的引物作用，單向擴增目的單鏈DNA作用。然后執(zhí)行低級PCR循環(huán)，隨機簡化，引物操作，以前用于線性放大的DNA產(chǎn)品可以變成雙鏈。此后，在擴增中，高準(zhǔn)嚴(yán)度和中準(zhǔn)嚴(yán)度周期交錯，目的順序擴增遠超過非特異性產(chǎn)物，控制特異性和非特異性產(chǎn)物的生成比例(圖8-10)。最后