1、.,1,疫苗中支原體的檢測,11級生技母若雨 指導(dǎo)教師：張麗嬌,.,2,主要內(nèi)容,1.支原體 2.支原體的危害 3.支原體的檢測方法,培養(yǎng)法,指示細(xì)胞培養(yǎng)法,.,3,1.支原體,又稱霉形體，為目前發(fā)現(xiàn)的最小的最簡單的原核生物。結(jié)構(gòu)也比較簡單，多數(shù)呈球形，沒有細(xì)胞壁，只有三層結(jié)構(gòu)的細(xì)胞膜，故具有較大的可變性。其大小介于細(xì)菌和病毒之間。可通過濾菌器，常給細(xì)胞培養(yǎng)工作及發(fā)酵和制藥滅菌帶來污染的麻煩。一般能以葡萄糖或精氨酸為主要碳源。,.,4,2.支原體的危害,致病支原體一般包括肺炎支原體，人型支原體，生殖器支原體。肺炎支原體引起支原體肺炎，又稱原發(fā)性非典型肺炎，支原體肺炎全年均可發(fā)病，以冬季多見，可

2、有小流行。人型支原體和生殖器支原體一般引起尿道及生殖器的感染。,.,5,3.1培養(yǎng)法,.,6,推薦培養(yǎng)基及其處方,（1）支原體肉湯培養(yǎng)基 豬胃消化液500ml 氯化鈉2.5g 牛肉浸液（1:2）500ml 葡萄糖 5.0g 酵母浸粉5.0g 酚紅0.02g pH值7.60.2于121滅菌15分鐘。 （2）精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基 豬胃消化液500ml 牛肉浸液（1:2）500ml 葡萄糖 1.0g 酵母浸粉5.0g L-精氨酸2.0g 酚紅0.02g 氯化鈉2.5g pH值7.10.2。于121滅菌15分鐘。 （3）支原體半流體培養(yǎng)基 按（1）項(xiàng)處方配制，培養(yǎng)基中不加酚紅，加 入瓊脂2.53.0

3、g。 （4）支原體瓊脂培養(yǎng)基 按（1）項(xiàng)處方配制，培養(yǎng)基中不加酚紅，加入 瓊脂13.015.0g。,.,7,培養(yǎng)基靈敏度檢測,（1）菌種肺炎支原體（ATCC 15531）、口腔支原體（ATCC 23714），由國家藥品檢定機(jī)構(gòu)分發(fā)。 （2）操作 將菌種接種于適宜的支原體培養(yǎng)基中，經(jīng)361培養(yǎng)至培養(yǎng)基變色，盲傳2代后，將培養(yǎng)物接種到待檢培養(yǎng)基中，做10倍系列稀釋，肺炎支原體稀釋至10-710-9，接種在支原體肉湯培養(yǎng)基內(nèi)；口腔支原體稀釋至10-310-5，接種在精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基內(nèi)。每個(gè)稀釋度接種3 支試管，置36 士1 培養(yǎng)7 14 天，觀察培養(yǎng)基變色結(jié)果。 ( 3 )結(jié)果判定 以接種后培

4、養(yǎng)基管數(shù)的2 / 3 以上呈現(xiàn)變色的最高稀釋度為該培養(yǎng)基的靈敏度。 液體培養(yǎng)基的靈敏度：肺炎支原體（ATCC 15531 ) 應(yīng)達(dá)到10-8 ，口腔支原體（ATCC 23714 ）應(yīng)達(dá)到10-4。,.,8,培養(yǎng)基處理,檢查支原體采用支原體半流體培養(yǎng)基和支原體肉湯培養(yǎng)基（或支原體瓊脂培養(yǎng)基）。支原體半流體培養(yǎng)基（或瓊脂培養(yǎng)基）在使用前應(yīng)煮沸10 15 分鐘，冷卻至56 左右，然后加人滅能新生牛血清（培養(yǎng)基與血清體積比為8:2 ) ，并可酌情加入適量青霉素，充分搖勻。液體培養(yǎng)基除無需煮沸外，使用前亦應(yīng)同樣補(bǔ)加上述成分。,.,9,接種培養(yǎng),取每支裝量為10ml 的支原體半流體培養(yǎng)墓（已冷至36 士1

5、 ）和支原體肉湯培養(yǎng)基各4 支，每支培養(yǎng)基接種供試品0.5 1.0ml ，置36 士1 培養(yǎng)21 天。于接種后的第7 天從4 支中取2 支進(jìn)行次代培養(yǎng)，每1 支培養(yǎng)基轉(zhuǎn)種支原體半流體培養(yǎng)基及支原體肉湯培養(yǎng)基各2 支，置36 士l 培養(yǎng)21 天，每隔3 天觀察1 次,.,10,結(jié)果判定,培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，如接種供試品的培養(yǎng)基均無支原體生長， 則供試品判為合格；如疑有支原體生長，可取加倍量供試品復(fù)試，如無支原體生長，供試品判為合格，如仍有支原體生長，則供試品判為不合格。,.,11,3.2指示細(xì)胞培養(yǎng)法（DNA染色法）,.,12,實(shí)驗(yàn)試劑制備,（1）二苯甲酰胺熒光染料濃縮液 稱取二苯甲酰胺熒光染料5mg

6、，加人100ml 不含酚紅和碳酸氫鈉的Hank s 平衡鹽溶液中，室溫下用磁力攪拌器攪拌3040 分鐘，使完全溶解，-20 避光保存。 （2）二苯甲酰胺熒光染料工作液 無酚紅和碳酸氫鈉的Hank s 溶液100ml 中加人二苯甲酰胺熒光染料濃縮液lml ，混勻。 （3）固定液 醋酸:甲醉（體積比1:3 ）混合溶液。 （4）封片液 量取0.1mol / L 枸櫞酸溶液22.2ml 、0.2mol / L 磷酸氫二鈉溶液27.8ml 、甘油50.0ml ，混勻，調(diào)pH 值至5.5 。,.,13,培養(yǎng)基及指示細(xì)胞處理,（1） DMEM 完全培養(yǎng)基。 ( 2 ) DMEM 無抗生素培養(yǎng)基。 ( 3 )

7、指示細(xì)胞（已證明無支原體污染的Vero細(xì)胞或其他傳代細(xì)胞） 取培養(yǎng)的Vero細(xì)胞經(jīng)消化后，制成每lml 含105 的細(xì)胞懸液，以每孔0.5ml 接種6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板或其他容器，每孔再加無抗生素培養(yǎng)基3ml ，于36 士1 、5 二氧化碳條件下培養(yǎng)過夜，備用。,.,14,供試品處理,（1）細(xì)胞培養(yǎng)物 將供試品經(jīng)無抗生素培養(yǎng)液至少傳1 代，然后取細(xì)胞已長滿的且3 天未換液的細(xì)胞培養(yǎng)上清液待檢。 （2）毒種懸液 如該毒種對指示細(xì)胞可形成病變并影響結(jié)果判定時(shí)，應(yīng)用對支原體無抑制作用的特異抗血清中和病毒后或用不產(chǎn)生細(xì)胞病變的另一種指示細(xì)胞進(jìn)行檢查。 （3）其他供試品 檢查時(shí)所選用的指示細(xì)胞應(yīng)為該供試品對

8、其生長無影響的細(xì)胞。,.,15,用指示細(xì)胞培養(yǎng)后固定封片,于制備好的指示細(xì)胞培養(yǎng)板中加入供試品（細(xì)胞培養(yǎng)上清液）2ml （毒種或其他供試品至少lml） , 于36 士1 、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)35 天。指示細(xì)胞培養(yǎng)物至少傳代1 次，末次傳代培養(yǎng)用含蓋玻片的6 孔培養(yǎng)板培養(yǎng)35 天后，吸出培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，加人固定液5ml ，放置5 分鐘，吸出固定液，再加5ml 固定液固定10 分鐘，吸出固定液，使蓋玻片在空氣中干操，加二苯甲酰胺熒光染料（或其他DNA 染料）工作液5ml ，加蓋，室溫放置30 分鐘，吸出染液，每孔用水5ml 洗3 次，吸出水，蓋玻片于空氣中干燥，取潔凈載玻片加封片液1 滴，分別將蓋玻片面向下蓋在封片液上制成封片。用熒光顯微鏡觀察。,.,16,陰性、陽性對照處理,用無抗生素培養(yǎng)基2ml 替代供試品，同法操作，作為陰性對照 用已知陽性的供試品標(biāo)準(zhǔn)菌株2ml 替代供試品，同法操作，作為陽性對照。,.,17,結(jié)果判定,（1）陰性對照 ：僅見指示細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)