1、重組人促紅細(xì)胞生成素的生產(chǎn)與應(yīng)用任雅怡3090102202摘要 重組人促紅細(xì)胞生成素是成功應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域的重組蛋白藥物產(chǎn)品?？蒲蓄I(lǐng)域?qū)ζ湫再|(zhì)和合成方法已有了成熟的了解。工業(yè)生產(chǎn)者也早已開(kāi)始大量生產(chǎn)重組人促紅細(xì)胞生成素，并且取得了不俗的市場(chǎng)成效。關(guān)鍵詞 重組人促紅細(xì)胞生成素 生產(chǎn)工藝 應(yīng)用 市場(chǎng)開(kāi)發(fā)一、 重組人促紅細(xì)胞生成素的性質(zhì)促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin,簡(jiǎn)稱EPO）最早于1906年被發(fā)現(xiàn)。EPO屬唾液糖蛋白激素，由165個(gè)氨基酸組成，為人體內(nèi)源性化合物，糖基化位點(diǎn)為Asn24、Asn28、Asn83和Ser126,有2對(duì)半胱氨酸組成的二硫鍵(Cys7-Cys61和Cys

2、29-Cys33)，分子量為3436 ku (SDS-PAGE)、30.4 ku(超濾)或60 ku（凝膠電泳），疏水性極強(qiáng),pI為3.754.15。它主要來(lái)源于腎臟（少量來(lái)源于肝臟），由皮質(zhì)管周圍的間質(zhì)細(xì)胞合成。由基因重組技術(shù)合成的rhEPO相對(duì)分子質(zhì)量為30400道爾頓，為含165個(gè)氨基酸糖的酸性糖蛋白，由哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生，結(jié)構(gòu)與天然EPO極為相似，其理化性質(zhì)和生物學(xué)活性與天然內(nèi)源性紅細(xì)胞生成素相同。其不同點(diǎn)是基因位點(diǎn)在7號(hào)染色體。在基因重組技術(shù)誕生前，EPO主要從貧血患者的尿和綿羊血中提取，提取率非常低，且極不穩(wěn)定，理化和生物性質(zhì)難以測(cè)定。1985年，人EPO基因克隆和表達(dá)的成功，使

3、rh-EPO的制備成為現(xiàn)實(shí)。二、 重組菌構(gòu)建過(guò)程 重組人紅細(xì)胞生成素，是以重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的紅細(xì)胞生成素，將紅細(xì)胞生成素的基因連接到表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化CHO細(xì)胞，從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中純化得到紅細(xì)胞生成素。重組人紅細(xì)胞生成素與天然人紅細(xì)胞生成素具有相同的體內(nèi)、體外活性，比活基本相當(dāng)。Jacob等人從基因文庫(kù)中克隆并測(cè)序了編碼紅細(xì)胞生成素的DNA片段，同時(shí)，以核酸探針從噬菌體cDNA文庫(kù)中篩選得到了編碼紅細(xì)胞生成素的cDNA片段，以此構(gòu)建了SV40病毒啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)的載體，在猴腎纖維母細(xì)胞COS-1中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，測(cè)得了紅細(xì)胞生成素的生物活性。Lin等人(1985)由人基因組中獲得編碼紅細(xì)胞生成素的

4、基因，將其轉(zhuǎn)入中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系（CHO）中，獲得穩(wěn)定的表達(dá)。 Quelle等人利用昆蟲(chóng)SF9細(xì)胞中的桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)rhEPO。雖然經(jīng)轉(zhuǎn)化的SF9細(xì)胞生產(chǎn)的rhEPO的產(chǎn)率有所改善，但是目標(biāo)產(chǎn)物rhEPO的糖基化程度較天然紅細(xì)胞生成素為小，因而其分子量亦較小。Mori等人構(gòu)建了一個(gè)含有干擾素-基因啟動(dòng)子的rhEPO表達(dá)載體，并利用該rhEPO表達(dá)載體轉(zhuǎn)化B細(xì)胞白血病BALL-1細(xì)胞。經(jīng)以仙臺(tái)病毒轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞白血病BALL-1細(xì)胞比現(xiàn)有技術(shù)所得的轉(zhuǎn)化株能產(chǎn)生較高量的rhEPO。重組紅細(xì)胞生成素在大腸桿菌中也得到表達(dá)，但所得rhEPO僅具有體外抗原結(jié)合活性。至于家蠶體內(nèi)的表達(dá)系統(tǒng)，也存在

5、糖基化簡(jiǎn)單，藥物在體內(nèi)穩(wěn)定性較低、活性較差等問(wèn)題。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞CHO、BHK細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)，獲得的重組紅細(xì)胞生成素與天然紅細(xì)胞生成素相似。故現(xiàn)在工業(yè)生產(chǎn)中多采用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)紅細(xì)胞生成素進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。三、 重組人促紅細(xì)胞生成素的生產(chǎn)工藝1、 表達(dá)紅細(xì)胞生成素的細(xì)胞系構(gòu)建紅細(xì)胞生成素表達(dá)載體有兩種方式獲得編碼人紅細(xì)胞生成素基因。一種是提取胎肝染色體DNA，然后以特異性寡核苷酸為引物，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出人紅細(xì)胞生成素的基因片段，然后與克隆載體連接，克隆基因。另一種是提取人胎肝mRNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA文庫(kù)，進(jìn)行文庫(kù)篩選，得到人紅細(xì)胞生成素基因。將人紅細(xì)胞生成素基因與表達(dá)質(zhì)粒重組，導(dǎo)入哺

6、乳動(dòng)物細(xì)胞，經(jīng)篩選得到表達(dá)人紅細(xì)胞生成素的細(xì)胞株。常用的表達(dá)載體有這兩種質(zhì)粒帶有二氫葉酸還原酶（dhfr）基因，也可以用不含dhfr基因的表達(dá)載體。常用的宿主細(xì)胞為CHO細(xì)胞。構(gòu)建載體經(jīng)過(guò)篩選后，必須通過(guò)測(cè)序，確證紅細(xì)胞生成素的DNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列是正確的。構(gòu)建表達(dá)紅細(xì)胞生成素的細(xì)胞株 以二氫葉酸還原酶缺陷型的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系（CHO dhfr-）為宿主細(xì)胞。將此細(xì)胞培養(yǎng)于100 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿至50%60%時(shí)，用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基淋洗細(xì)胞，加入由無(wú)血清培養(yǎng)基、表達(dá)載體和共轉(zhuǎn)化載體，以及l(fā)ipofectin組成的共轉(zhuǎn)染混合液，37培養(yǎng)4小時(shí)。吸出培養(yǎng)基，加入含10%胎牛血清

7、的F12培養(yǎng)基，37培養(yǎng)過(guò)夜。隨后在含青霉素、鏈霉素及10%胎牛血清的DEME中培養(yǎng)，獲得抗性克隆。逐步提高M(jìn)TX終濃度，篩選抗性克隆。利用酶聯(lián)免疫分析法確認(rèn)所得到的細(xì)胞表達(dá)人紅細(xì)胞生成素。2、 CHO細(xì)胞培養(yǎng)工藝過(guò)程在獲得了能夠高效表達(dá)目的蛋白的重組細(xì)胞株以后，需要解決的問(wèn)題就是通過(guò)培養(yǎng)而大量生產(chǎn)出目的蛋白。常規(guī)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的方法是將細(xì)胞放在不同的容器中進(jìn)行培養(yǎng)。如利用轉(zhuǎn)瓶大量培養(yǎng)貼壁細(xì)胞或用生物反應(yīng)器培養(yǎng)貼壁或懸浮細(xì)胞。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞工藝簡(jiǎn)單，規(guī)模易于擴(kuò)大，污染易于控制，一直用于疫苗工業(yè)的生產(chǎn)，是傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)工藝。美國(guó)Amgen公司是世界上最早獲得人紅細(xì)胞生成素生產(chǎn)和上市的企業(yè)，采用的

8、生產(chǎn)工藝即是轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)生產(chǎn)工藝。以下介紹生物反應(yīng)器培養(yǎng)工藝。種子細(xì)胞制備（1）凍存的細(xì)胞株37水浴復(fù)蘇，無(wú)菌離心，棄去凍存液。（2）加入適量DMEM培養(yǎng)基（含10%小牛血清）。（3）37二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，連續(xù)傳三代。（4）細(xì)胞消化后接種，接種的細(xì)胞濃度約為2.5106個(gè)/ml。 反應(yīng)器連續(xù)培養(yǎng)（1）加入纖維素載體片及pH7.0的PBS緩沖液，5L細(xì)胞反應(yīng)器高壓滅菌1.5小時(shí)。（2）將反應(yīng)器接入主機(jī)，連接氣體，校正電極，排出PBS緩沖液。加含有小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，接種?？刂茥l件pH7.0，攪拌轉(zhuǎn)速1.2105 IU/mg。四、 重組人促紅細(xì)胞生成素的應(yīng)用1、應(yīng)用情況概述重組人紅細(xì)胞生成素（

9、rhuEPO）是最早用于臨床的重組基因工程藥物之一，可促進(jìn)骨髓內(nèi)原始血細(xì)胞加速分化，促進(jìn)有核紅細(xì)胞加快成熟及血紅蛋白合成，刺激網(wǎng)織紅細(xì)胞和成熟紅細(xì)胞釋放，并穩(wěn)定紅細(xì)胞膜，提高紅細(xì)胞膜抗氧化酶功能。rhuEPO最初主要用于治療慢性腎性貧血，之后隨著對(duì)眾多疾病相關(guān)性貧血的病理生理過(guò)程以及EPO、鐵和紅細(xì)胞生成三者間相互關(guān)系的深入認(rèn)識(shí)，EPO的臨床應(yīng)用逐步擴(kuò)展。EPO現(xiàn)階段的臨床應(yīng)用主要有治療慢性腎病、獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）、腫瘤、充血性心力衰竭、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、認(rèn)知功能受損、丙型肝炎病毒（HCV）感染等疾病患中、治療中或恢復(fù)期的貧血和組織缺氧癥狀。2、臨床試驗(yàn)效用以下結(jié)論來(lái)自一些具體相

10、關(guān)臨床試驗(yàn)的研究文獻(xiàn)： rhuEPO明顯促進(jìn)紅細(xì)胞生成，安全、可靠地改善妊娠期貧血。 大劑量治療多發(fā)性骨髓瘤患者相關(guān)性貧血優(yōu)于數(shù)學(xué)，其起效快、療效好，患者生活幸福感改善明顯，費(fèi)用成本低，安全性好。 應(yīng)用重組人促紅細(xì)胞生成素可以明顯改善肝移植受者術(shù)前存在的貧血狀態(tài)，減少術(shù)中異體血液的輸注量和術(shù)后繼續(xù)需要輸注異體血液的可能。 惡性血液病完全緩解的患者鞏固化療中，應(yīng)用rhEPO2萬(wàn)U每周1次療法治療化療相關(guān)性貧血可以減少輸血量和相關(guān)治療費(fèi)用，并減少輸血相關(guān)副作用和患者的痛苦。 rhuEPO預(yù)處理（皮下注射）能減輕二尖瓣置換術(shù)患者的血清心肌酶及肌鈣蛋白表達(dá)，具有顯著的保護(hù)心肌作用。 rhEPO治療能促

11、進(jìn)新生兒缺氧缺血性腦病（HIE）患兒神經(jīng)功能的早期回復(fù)，除對(duì)紅細(xì)胞增生有促進(jìn)作用外，對(duì)其他系統(tǒng)無(wú)不良反應(yīng)。 重組人促紅細(xì)胞生成素不僅能改善慢性腎功能衰竭維持性血液透析患者的貧血狀態(tài)，而且可改善患者的營(yíng)養(yǎng)狀況和紅細(xì)胞免疫功能。 EPO能改善急性病毒性心肌炎臨床癥狀，減輕心肌損傷，降低心律失常、急性左心衰發(fā)生率。五、 重組人促紅細(xì)胞生成素的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)狀況1985年科學(xué)家應(yīng)用基因重組技術(shù)，在實(shí)驗(yàn)室獲得重組人促紅細(xì)胞生成素（rhEPO）。自從1989年FDA批準(zhǔn)紅細(xì)胞生成素Amgen公司Epogen、Ortho Biotech公司Procrit 用于臨床連續(xù)治療需要透析的慢性腎衰病人以來(lái)，很多國(guó)家也已經(jīng)

12、批準(zhǔn)紅細(xì)胞生成素上市和生產(chǎn)，并且市場(chǎng)表現(xiàn)不俗。重組紅細(xì)胞生成素(EPO)目前的銷售額一直排在生物醫(yī)藥類產(chǎn)品的前三名，每年的增長(zhǎng)率在10以上。Amgen公司開(kāi)發(fā)的用于治療惡性貧血癥的第二代促紅細(xì)胞生成素新產(chǎn)品Arnesp2001年得到FDA的批準(zhǔn)，Arnesp2002年初正式上市。Arnesp是一種“高糖基化”促紅素產(chǎn)品，其促進(jìn)紅細(xì)胞生成的能力大大優(yōu)于第一代EPO（促紅細(xì)胞生成素）產(chǎn)品。第一年上市即大獲全勝，贏得開(kāi)們紅，Aranesp2002年全年銷售額為4.2億美元，2003年全年銷售額為15.4億美元,市場(chǎng)前景不可估量。同時(shí)，強(qiáng)生（Johnson&Johnson）公司的促紅細(xì)胞生成素Proc

13、rit/Eprex更是表現(xiàn)不俗，2001年銷售額34.42億美元，2002年銷售額42.69億美元， 2003年銷售收入達(dá)到39.84億美元。 2001年，EPO（包括Arnesp）的全球銷售額達(dá)21.1億美元，2002年達(dá)26.8億美元，2003年全世界EPO的年銷售額超過(guò)50億美元。2005年全球EPO市場(chǎng)比上一年的119.2億美元增長(zhǎng)5.2%，達(dá)到120多億美元，一舉成為世界醫(yī)藥市場(chǎng)上首個(gè)單品突破百億美元的藥品，從而占據(jù)了全球生物基因工程藥品的份額的五分之一，創(chuàng)下生物工程藥品單個(gè)品種之最，是當(dāng)今最成功的基因工程藥物。 目前，國(guó)內(nèi)已有10多家單位獲準(zhǔn)生產(chǎn)紅細(xì)胞生成素。沈陽(yáng)三生和上海麒麟鯤鵬

14、（中國(guó)）生物藥業(yè)的產(chǎn)品在國(guó)內(nèi)醫(yī)院的銷售額獨(dú)領(lǐng)風(fēng)騷，2001年EPO的國(guó)內(nèi)醫(yī)院銷售總額約為47449萬(wàn)元，2002年為49508萬(wàn)元，2003年上半年為28606萬(wàn)元。參考文獻(xiàn)【1】 徐志利.重組人促紅細(xì)胞生成素的制備及臨床應(yīng)用J.藥學(xué)研究，1993年第2期.【2】 朱綠松，傘德忠，李振武，高晶，候曉薇，彭文廣.重組人促紅細(xì)胞生成素生產(chǎn)工藝研究J.藥物研究，2001年第4期.【3】 高云莉.EPO的市場(chǎng)現(xiàn)狀及展望J.中國(guó)新藥雜志，2001年第2期.【4】 劉麗英.重組人促紅細(xì)胞生成素治療妊娠期貧血患者的臨床觀察J.山西醫(yī)藥雜志，2008年11月【5】 李元敏，宋兵，劉瑞生，唐漢博.重組人促紅細(xì)胞生成素對(duì)瓣膜置換術(shù)患者心肌保護(hù)作用J.臨床心血管病雜志，2009年4月.【6】 韓勁草，劉喜林，凌文革. 重組人促紅細(xì)胞生成素對(duì)急性病毒性心肌炎治療作用的臨床觀察J.臨床急診雜志，2009年12月.【7】 劉瑜，徐娟，常紅，向兵，朱煥玲，徐才剛.大劑量重組人促紅細(xì)胞生成素在多發(fā)性骨髓瘤貧血中的應(yīng)用J.華西醫(yī)學(xué)，2009年.【8】 孔慶勝，趙守業(yè)，楊敏，彭志海. 重組人促紅細(xì)胞生成素在肝癌行肝移植患