1、第2節(jié) 基因工程的基本操作程序,基因工程基本操作的四個步驟：,第一步：目的基因的獲取,第二步：基因表達載體的構建,第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞,第四步：目的基因的檢測與鑒定,一、目的基因的獲取,1. 什么是目的基因？,主要是指編碼蛋白質(zhì)的結構基因。,補充：基因的結構,啟動子,終止子,(1)原核基因的結構：,與RNA聚合酶結合位點,轉(zhuǎn)錄起點,轉(zhuǎn)錄終點,終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄,啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì),一、目的基因的獲取,1. 什么是目的基因？,主要

2、是指編碼蛋白質(zhì)的結構基因。,補充：基因的結構,(2)真核基因的結構：,一、目的基因的獲取,1. 什么是目的基因？,主要是指編碼蛋白質(zhì)的結構基因。,2. 獲取方法：,(1)從基因文庫中獲?。?基因文庫：,將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因。,基因文庫的分類：,按外源DNA片段的來源分類,含有一種生物的全部基因,含有一種生物的部分基因,一、目的基因的獲取,1. 什么是目的基因？,主要是指編碼蛋白質(zhì)的結構基因。,2. 獲取方法：,(1)從基因文庫中獲?。?獲取目的基因的根據(jù)：,根據(jù)目的基因的有關信息，例如，根據(jù)基因的核苷酸序列、基因的

3、功能、基因在染色體上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA，以及基因的表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性來獲取目的基因。,建立基因文庫的目的：,為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。,(1)從基因文庫中獲?。?基因文庫的構建：,基因組文庫的構建：直接分離法(鳥槍法),提取某種生物的全部DNA,用適當?shù)南拗泼盖?一定大小的DNA片段,將DNA片段與載體連接,導入受體菌中儲存,基因組文庫,(1)從基因文庫中獲?。?基因文庫的構建：,cDNA文庫的構建：反轉(zhuǎn)錄法,某種生物的單鏈mRNA,單鏈互補DNA,雙鏈cDNA片段,導入受體菌中儲存,與載體連接,cDNA文庫,反(逆)轉(zhuǎn)錄酶,DNA聚合酶,(1)從基

4、因文庫中獲?。?基因文庫的構建：,基因組文庫和cDNA文庫的區(qū)別：,一、目的基因的獲取,1. 什么是目的基因？,主要是指編碼蛋白質(zhì)的結構基因。,2. 獲取方法：,(1)從基因文庫中獲取：,從基因文庫中獲取目的基因的優(yōu)點：,操作簡便。,從基因文庫中獲取目的基因的缺點：,工作量大，具有一定的盲目性。,一、目的基因的獲取,2. 獲取方法：,(2)利用PCR技術擴增目的基因：,什么是PCR？,PCR全稱為聚合酶鏈式反應，是一項在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術。,PCR的原理：,利用DNA雙鏈復制的原理。,條件：,要有一段已知目的基因的核苷酸序列【前提條件】、四種脫氧核苷酸、引物、熱穩(wěn)定DNA

5、聚合酶(Taq酶)等。,(2)利用PCR技術擴增目的基因：,過程：,(2)利用PCR技術擴增目的基因：,過程：,A. 變性(90-95)：,雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。,B.退火(55-65)：,系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。,C.延伸(70-75)：,在Taq酶的作用下，從引物的5端3端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。,D.多次重復：,一、目的基因的獲取,2. 獲取方法：,(2)利用PCR技術擴增目的基因：,方式：,以指數(shù)方式擴增，即2n(n為擴增循環(huán)的次數(shù))。,PCR技術擴增與DNA復制的比較：,堿基互補配對,四種脫氧核苷酸,模板、能量、酶,DN

6、A在高溫下變性解旋,解旋酶催化,體外復制,細胞核內(nèi),熱穩(wěn)定的DNA聚合酶,細胞內(nèi)的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整個DNA分子,2. 獲取方法：,(2)利用PCR技術擴增目的基因：,一、目的基因的獲取,2. 獲取方法：,(3)化學方法人工合成：,如果基因比較小，核苷酸序列又已知，也可以通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成。,一、目的基因的獲取,練一練：,1.多聚酶鏈式反應(PCR)是一種體外迅速擴增DNA片段的技術。PCR過程一般經(jīng)歷下述三十多次循環(huán)：95下使模板DNA變性、解鏈55下復性(引物與DNA模板鏈結合)72下引物鏈延伸(形成新的脫氧核苷酸鏈)。下列有關PCR過程的敘述中不正

7、確的是( ) A變性過程中破壞的是DNA分子內(nèi)堿基對之間的氫鍵，也可利用解旋酶實現(xiàn) B復性過程中引物與DNA模板鏈的結合是依靠堿基互補配對原則完成 C延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP、四種核糖核苷酸 DPCR與細胞內(nèi)DNA復制相比所需要酶的最適溫度較高,C,一、目的基因的獲取,練一練：,2.獲取目的基因的方法有多種，下列不屬于目的基因獲取方法的是( ) A從基因組文庫中獲取 B從cDNA文庫中獲取 C從含目的基因生物細胞中獲取 D利用PCR技術獲取,C,3. PCR技術擴增DNA，需要的條件是( ) 目的基因 引物 四種脫氧核苷酸 DNA聚合酶等 mRNA 核糖體 A B C D,A,一、目

8、的基因的獲取,練一練：,4. 有關基因工程的敘述正確的是( ) A限制酶只在獲取目的基因時才用 B重組質(zhì)粒的形成是在細胞內(nèi)完成的 C質(zhì)粒都可以作為運載體 D蛋白質(zhì)的氨基酸排列順序可以為合成目的基因提供線索,D,5.在基因工程技術中，下列方法與目的基因獲得無關的是( ) A輻射誘變法 B從基因文庫中獲取 C反轉(zhuǎn)錄法 D人工合成法,A,一、目的基因的獲取,練一練：,6.下列關于基因工程的說法中，正確的是( ) A基因工程的設計和施工都是在細胞水平上進行的 B目前基因工程所有的目的基因都是從供體細胞中直接分離得到的 C只要檢測出受體細胞中含有目的基因，那么目的基因一定能成功進行表達 D基因工程能使科

9、學家打破物種界限，定向改造生物性狀,D,一、目的基因的獲取,練一練：,7.下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈的是( ) 從基因文庫中獲取目的基因 利用PCR技術擴增目的基因 反轉(zhuǎn)錄法 通過DNA合成儀利用化學方法人工合成 A B C D,D,二、基因表達載體的構建,1. 構建目的：,使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。,2. 基因表達載體的組成：,二、基因表達載體的構建,1. 構建目的：,使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。,2. 基因表達載體的組成：,想一想：啟動子、終止子和標記基因分

10、別有什么作用？,啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)，但啟動子本身不被轉(zhuǎn)錄。,終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄。,標記基因：鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來。,二、基因表達載體的構建,3. 構建表達載體：,一個切口 兩個黏性末端,二、基因表達載體的構建,3. 構建表達載體：,限制酶,黏性末端,同一種限制酶,切口,堿基互補配對原則,相同的黏性末端,DNA連接酶,二、基因表達載體的構建,3. 構建表達載體：,特別提醒：,(1)用限制酶切割載體和含

11、目的基因的DNA分子時，可以使用不同的限制性核酸內(nèi)切酶,但是必須切出相同黏性末端。,(2)不同基因可以拼接的原因：不同生物的基因具有相同的結構和化學組成，都是雙螺旋結構，都由四種脫氧核糖核苷酸組成，都遵循相同的堿基互補配對原則：AT，GC。,(3)目的基因與載體的結合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程。,二、基因表達載體的構建,練一練：,1.如圖為基因表達載體的模式圖，下列有關基因工程中載體的說法錯誤的是(),A基因工程的核心步驟是基因表達載體構建 B任何基因表達載體的構建都是一樣的，沒有差別 C圖中啟動子位于基因的首端，是RNA聚合酶識別和結合的部位 D抗生素抗性基因的作用是作為標記基因

12、，用于鑒別受體細胞中是否導入了目的基因,B,二、基因表達載體的構建,練一練：,2.下列操作中不屬于基因表達載體構建過程的是( ) A.用一定的限制酶切割質(zhì)粒露出黏性末端 B.用同一種限制酶切割目的基因露出黏性末端 C.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒切口處 D.將重組DNA導入受體細胞中,D,3.下列哪項不是基因表達載體的組成部分( ) A.啟動子 B.終止子 C.標記基因 D.復制原點,D,二、基因表達載體的構建,練一練：,4.下列關于基因表達載體的敘述不正確的是( ) A啟動子是與RNA聚合酶識別和結合的部位，是起始密碼 B啟動子和終止子都是特殊結構的DNA短片段，對mRNA的轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用

13、C標記基因是為了鑒別受體細胞中是否有目的基因從而便于篩選 D基因表達載體的構建視受體細胞及導入方式不同而有所差別,A,三、將目的基因?qū)胧荏w細胞,1. 什么是轉(zhuǎn)化？,目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在 受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程。,2.常用的受體細胞：,大腸桿菌、枯草桿菌、農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細胞等。,3.將目的基因?qū)胧荏w細胞的原理：,借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。,三、將目的基因?qū)胧荏w細胞,4. 將目的基因?qū)胫参锛毎?適用范圍：,(1)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法：,雙子葉植物和裸子植物。,小知識：植物的分類,三、將目的基因?qū)胧荏w細胞,4. 將目的基因?qū)胫参锛毎?農(nóng)桿菌特點：,(1)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)

14、化法：,在自然條件下感染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。當植物受到損傷時，傷口處的細胞會分泌大量的酚類化合物，吸引農(nóng)桿菌移向這些細胞，這時農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細胞，并整合到受體細胞染色體DNA上。,三、將目的基因?qū)胧荏w細胞,4. 將目的基因?qū)胫参锛毎?轉(zhuǎn)化過程：,(1)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法：,三、將目的基因?qū)胧荏w細胞,4. 將目的基因?qū)胫参锛毎?(2)基因槍法：,適用范圍： 適用于單子葉植物，但成本較高。,三、將目的基因?qū)胧荏w細胞,4. 將目的基因?qū)胫参锛毎?(3)花粉管通道法：,適用范圍： 適用于被子植物，且十分簡便經(jīng)濟。,三、將目的基

15、因?qū)胧荏w細胞,5. 將目的基因?qū)雱游锛毎?(1)導入方法：,顯微注射法。,(2)過程：,目的基因表達載體提純從雌性動物內(nèi)取出卵(卵在體內(nèi)或體外受精)并進行顯微注射 含目的基因的受精卵胚胎早期培養(yǎng)至囊胚期再移植到雌性動物輸卵管或子宮，使其發(fā)育成具有新性狀的動物。,三、將目的基因?qū)胧荏w細胞,6. 將目的基因?qū)胛⑸铮?(1)原核生物特點：,繁殖快、單細胞、遺傳物質(zhì)少。,(2)方法：,用Ca2+處理細胞感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA分子。,三、將目的基因?qū)胧荏w細胞,知識拓展：,(1)不同生物的受體細胞不同：植物一般為體細胞(也可以受精卵)，動物一般為受精卵，微生物

16、一般為大腸桿菌。,(2)上圖中發(fā)生與發(fā)生相比，會使目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達，原因是在進行細胞分裂時，細胞核上的DNA經(jīng)復制后平均分配到兩個子細胞中，保證了親子代遺傳性狀的穩(wěn)定性，而細胞分裂時，細胞質(zhì)是不均分的，子細胞不一定含有目的基因。,三、將目的基因?qū)胧荏w細胞,練一練：,1.基因工程中科學家常采用細菌、酵母菌等微生物作為受體細胞，主要原因是( ) A結構簡單，操作方便 B繁殖速度快 C遺傳物質(zhì)含量少、簡單 D性狀穩(wěn)定,變異少,B,2.在培育下列作物的轉(zhuǎn)基因品種時，適合用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導入目的基因的是( ) A小麥 B玉米 C大豆 D水稻,C,三、將目的基因?qū)胧荏w細胞,練一練：,

17、3.采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導入目的基因的做法正確的是( ) 將毒素蛋白注射到棉受精卵中 將編碼毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中 將編碼毒素蛋白的DNA序列，與質(zhì)粒重組，導人細菌，用該細菌感染棉的體細胞，再進行組織培養(yǎng) 將編碼毒素蛋白的DNA序列，與細菌質(zhì)粒重組，注射到棉的子房并進入受精卵 A. B. C. D.,C,三、將目的基因?qū)胧荏w細胞,練一練：,4.回答有關基因工程的問題： (1)構建基因工程表達載體時，用不同類型的限制酶切割DNA后，可能產(chǎn)生黏性末端，也可能產(chǎn)生_末端。若要在限制酶切割目的基因和質(zhì)粒后使其直接進行連接，則應選擇能使二者產(chǎn)生_(相同、不同)黏性末端的限

18、制酶。 (2)利用大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素時，構建的表達載體含有人胰島素基因及其啟動子等，其中啟動子的作用是 _。在表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌時，常用_處理大腸桿菌，以利于表達載體進入；為了檢測胰島素基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，可用標記的胰島素基因片段作探針與mRNA雜交，該雜交技術稱為_。為了檢測胰島素基因轉(zhuǎn)錄的mRNA是否翻譯成_，常用_雜交技術。,平,相同,RNA聚合酶識別和結合的位點，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需要的蛋白質(zhì),人胰島素,Ca2,DNA分子雜交技術,抗原抗體,三、將目的基因?qū)胧荏w細胞,練一練：,4.回答有關基因工程的問題： (3)如果要將某目的基因通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導

19、入植物細胞，先要將目的基因插入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的_中，然后用該農(nóng)桿菌感染植物細胞，通過DNA重組將目的基因插入植物細胞的_上。,TDNA,染色體的DNA,四、目的基因的檢測與鑒定,1. 分子水平的檢測：,(1)導入檢測：即檢測轉(zhuǎn)基因生物的DNA上是否插入了目的基因。,這是目的基因能夠在受體細胞中穩(wěn)定遺傳的關鍵。,方法：,DNA分子雜交技術。,過程：,將轉(zhuǎn)基因生物的DNA提取出來，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作標記，以此作為探針，使探針與基因組DNA雜交，如果顯示出雜交帶，就表明目的基因已插入染色體DNA中。,過程：,放射性同 位素標記,顯示出雜交帶,不能顯示出雜交帶,四、目的基因

20、的檢測與鑒定,1. 分子水平的檢測：,(1)導入檢測：即檢測轉(zhuǎn)基因生物的DNA上是否插入了目的基因。,方法：,DNA分子雜交技術。,過程：,檢測受體細胞是否具有標記基因所控制的性狀，如果具有標記基因所控制的性狀，就表明受體細胞中含有目的基因，從而可以篩選出含有目的基因的受體細胞。,想一想：欲檢測受體細胞中是否含有目的基因，除了DNA分子雜交法外，可以如何檢測？,四、目的基因的檢測與鑒定,1. 分子水平的檢測：,(2)轉(zhuǎn)錄檢測：即檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA。,這是檢測目的基因是否發(fā)揮功能作用的第一步。,方法：,(DNA-RNA)分子雜交技術。,過程：,從轉(zhuǎn)基因生物中提取出mRNA，在含有目

21、的基因的DNA片段上用放射性同位素等作標記，以此作為探針，使探針與mRNA雜交，如果顯示出雜交帶，就表明目的基因在轉(zhuǎn)基因生物中已經(jīng)轉(zhuǎn)錄出了mRNA。,過程：,放射性同 位素標記,顯示出雜交帶,不能顯示出雜交帶,四、目的基因的檢測與鑒定,1. 分子水平的檢測：,(3)翻譯檢測：即檢測目的基因是否翻譯成相應的蛋白質(zhì)。,這是檢測目的基因是否發(fā)揮功能作用的第二步。,方法：,抗原抗體雜交技術。,過程：,從轉(zhuǎn)基因生物中提取出蛋白質(zhì)，用相應的抗體進行抗原抗體雜交，如果顯示出雜交帶，就表明目的基因已形成蛋白質(zhì)產(chǎn)品。,過程：,目的基因,轉(zhuǎn)基因生物中蛋白質(zhì),目的基因已形成蛋白質(zhì),四、目的基因的檢測與鑒定,2. 個

22、體生物學水平的鑒定：,(1)實例1：一個抗蟲或抗病的基因?qū)胫参锛毎螅欠褓x予了抗蟲或抗病的特性，需要做抗蟲或抗病的接種實驗，以確定是否具有抗性以及抗性的程度。,(2)實例2：有的基因工程產(chǎn)品需要與天然產(chǎn)品進行功能活性比較，以確定轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的功能活性是否與天然產(chǎn)品相同。,四、目的基因的檢測與鑒定,練一練：,1.1976年,美國的科學家首次將人的生長抑制素釋放因子的基因轉(zhuǎn)移到大腸桿菌,并獲得了表達，此文中的表達是指該基因在大腸桿菌( ) A.能進行DNA復制 B.能傳遞給細菌后代 C.能合成生長抑制素釋放因子 D.能合成人的生長素,C,四、目的基因的檢測與鑒定,練一練：,2利用外源基因在受體細

23、胞中表達，可生產(chǎn)人類所需要的產(chǎn)品。下列選項中能說明目的基因完成了在受體細胞中表達的是( ) A棉花二倍體細胞中檢測到細菌的抗蟲基因 B大腸桿菌中檢測到人胰島素基因及其mRNA C山羊乳腺細胞中檢測到人生長激素DNA序列 D酵母菌細胞中提取到人干擾素蛋白,D,五、課堂練習,1.基因工程是在DNA分子水平上進行設計施工的,在基因操作的基本步驟中,不進行減基互補配對的步驟是 ( ) A.人工合成目的基因 B.目的基因與載體結合 C.將目的基因?qū)胧荏w細胞 D.目的基因的檢測和表達,C,五、課堂練習,2.下列關于基因工程的敘述，錯誤的是( ) A目的基因和受體細胞均可來自動、植物或微生物 B限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶是兩類常用的工具酶 C人胰島素原基因在大腸桿菌中表達的胰島素原無生物活性 D載體上的抗性基因有利于篩選含重組DNA的細胞和促進目的基因的表達,D,五、課堂練習,3.為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關注。我國科學家應用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。 (1)獲得耐鹽基因后，構建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的_處，DNA連接酶作用于_處。(填“a”或“b”),a,a,五、課堂練習,3.為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿