1、進(jìn)出口動物源性食品中沃尼妙林及其同系物泰妙菌素殘留量的測定方法 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法作成說明一、任務(wù)來源本標(biāo)準(zhǔn)按照國家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會頒發(fā)的河北出入境檢驗檢疫局負(fù)責(zé)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)修改任務(wù)。 這個標(biāo)準(zhǔn)名稱是進(jìn)出口動物源性食品中沃尼妙林及其同系物泰妙菌素殘留量的測定方法 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，修訂版號是2011b141。二、編制依據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)是應(yīng)gb/t 1.1-2009 標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫的規(guī)則、gb/t 20001.4-2001 標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則 第4部分：化學(xué)分析方法、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)sn/t0001-1995 出口商品中農(nóng)藥、獸藥殘留量及生物毒素檢驗方法標(biāo)準(zhǔn)編寫的基本規(guī)定 (

2、以下簡稱基本規(guī)定 )的要求制定的。三、研究背景中國蜂蜜出口消費地大多是日本、美國、歐盟等世界貿(mào)易組織和環(huán)境委員會的成員。 2002年，歐盟為氯霉素、連翹酯切耳類衍生物，是二萜類半合成抗生素，抗菌活性強，用于家畜感染性疾病的治療，特別是對豬痢疾、豬拉肚子及霉菌體肺炎有很好的治療和預(yù)防效果，故選用獸藥和飼料添加劑但是，動物長期食用這種抗生素會在體內(nèi)產(chǎn)生積累，而且有些飼養(yǎng)者為了單方面追求經(jīng)濟(jì)利益，會過量添加這種抗生素，使這種抗生素殘留下來，然后這種抗生素通過食物鏈進(jìn)入人體，對人類健康造成嚴(yán)重威脅7。 例如，長期食用留有泰坦的食品，可能會引起人腸道細(xì)菌菌群失調(diào)和結(jié)腸炎等危險8。 因此，世界各國對動物組

3、織及相關(guān)產(chǎn)品中的沃尼奇林和泰國偉大抗生素殘留量做出了嚴(yán)格的限定。 例如，emea和我國都規(guī)定了時機和聯(lián)合胺的最高殘留量9 :肌肉中的時機為100g/kg，聯(lián)合胺為50g/kg，肝臟中為500g/kg。 日本農(nóng)林漁業(yè)部(maff )在動物肝臟、脂肪、肌肉組織中對沃尼妙林和泰國妙抗生素的最高殘留量為0.04-6 mg/kg。我國是家畜的飼養(yǎng)、生產(chǎn)、消費和貿(mào)易大國，家畜肉出口市場主要集中在日本、韓國和歐盟等。 但是，中國的肉類在出口中超過藥物殘留標(biāo)準(zhǔn)而被拒絕進(jìn)口國外的事件屢次發(fā)生。 另外，日本在06年提出了肯定列表制度，該制度大幅度提高了進(jìn)口農(nóng)產(chǎn)品食品的進(jìn)入閾值。 因此，為有效控制泰霉素和黃芩苷的安

4、全使用，保證產(chǎn)品的食用安全，打破國外技術(shù)壁壘，保證產(chǎn)品的順利出口，有必要建立動物來源食品中泰霉素和黃芩苷殘留量的檢測標(biāo)準(zhǔn)和方法。目前，關(guān)于這兩種抗生素檢測技術(shù)，主要有氣相色譜(gc)10、高效液相色譜(hplc)11-14和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(hplc-ms/ms )法15-23的gc法衍生化由于高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(hplc-ms/ms )因其操作簡便、準(zhǔn)確度高、靈敏度高、選擇性強等優(yōu)點成為各種獸藥殘留的實證方法，因此本文采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜同時測定肉中泰霉素和黃芩苷的殘留量考察了預(yù)處理條件和儀器測量殘奧表，為此，本標(biāo)準(zhǔn)采用固相萃取技術(shù)凈化樣品，電離電噴霧，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

5、(lc-ms/ms )檢測，外標(biāo)法定量，沃尼很棒四、方法概述(1)選擇有代表性的5種常見的進(jìn)出口動物來源食品(動物組織、內(nèi)臟、魚、蛋和乳)的基質(zhì)進(jìn)行研究，經(jīng)過凈化方法的選擇試驗、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜和實證條件試驗，最終用乙腈提取樣品中的波尼菲和茶堿， 用oasismcx spe柱凈化的本方法科學(xué)合理，技術(shù)先進(jìn)，便于國際對等技術(shù)交流，同時完全滿足國外檢驗限量的需要。(2)本方法經(jīng)過了回收率試驗、精密度試驗、方法驗證試驗。 結(jié)果表明，各項技術(shù)指標(biāo)均完全滿足檢測需求。五、實驗技術(shù)論證5.1樣品預(yù)處理條件的選擇5.1.1提取條件的選擇文獻(xiàn)報道16-19分別用三氯乙酸水(1 19，w:v )、乙酸乙酯和乙腈

6、作提取液，比較提取效果，結(jié)果顯示乙腈提取效果高，且提取雜質(zhì)少，可有效避免基質(zhì)干擾。5.1.2凈化條件的選擇樣品提取中的基質(zhì)雜質(zhì)顯著抑制離子化效率，導(dǎo)致儀器靈敏度降低。 本實驗采用乙腈萃取只能去除部分油脂和水溶性雜質(zhì)，如果不用spe柱進(jìn)行凈化，質(zhì)譜將產(chǎn)生較強的基質(zhì)效應(yīng)。 oasis mcx spe柱是一種新型混合型強陽離子交換、潤濕性聚合物吸附劑，對堿性化合物具有高選擇性和靈敏度。 本實驗的對象物為弱堿性化合物，用5 %甲酸水溶液氧化后，以離子化的形式固定在強陽離子交換點，除去基質(zhì)中的蛋白質(zhì)和鹽類，用純甲醇和正己烷洗脫除去酸性和中性干擾物，最后用5 %氨水甲醇溶液洗脫目標(biāo)堿性干擾物，制成疏水性堿

7、另外，實驗比較了mcx(150mg，6ml )和mcx(60mg，3 ml ) 2種固相萃取柱的凈化效果，結(jié)果表明，mcx(3ml，60mg )的固相萃取柱得到的回收率高。5.2測量條件的選擇5.2.1液相條件的選擇使用acquity beh c18 uplc柱，填充劑的粒徑為1. 7m，與以往的液相柱相比，具有更高的靈敏度、更強的分離能力和更短的分析時間，能夠在短時間內(nèi)最大限度地高效地分離被測定物成分。 采用不同的洗脫梯度分別考察了波尼菲和三聯(lián)苯的分離效果，降低流動相中乙腈的比例可以有效地分離兩者，但同時導(dǎo)致靈敏度降低，最終選擇了表1所示的梯度洗脫程序，得到了良好的分離度和靈敏度。 為了進(jìn)一

8、步提高兩者在正離子模式下的靈敏度和分離度，分別研究了在流動相中添加甲酸體積分率為0.05 %、0.1 %、0.2 %、0.5 %時的色譜靈敏度和分離度，結(jié)果表明，添加0.1 %甲酸水溶液時的被測物成分的分離效果和靈敏度最好。圖1為優(yōu)化條件下沃尼妙林和泰國妙抗生素的選擇離子流圖，其總保留時間為4.22min。 華尼妙林和泰國妙抗生素保留時間分別為2. 09、1. 98 min，分離效果良好，分析時間為4 min。最終選擇液相色譜殘奧儀。色譜柱： acquity uplc beh c18柱，(100 mm2.1 mm，1.7 m )； 流速：0.3ml/min； 試樣注入量： 10l； 柱溫： 3

9、0； 流動相：甲酸(1 999 )溶液(a )和乙腈(b )、梯度溶出、參考梯度條件如表1所示表1 .流動相溶出梯度表tab.1移動phaseelutiongradienttable時間/分鐘流速/升/分鐘a/%。b/%。03009550.830060402.330040602.43005954300595(a )(c )(b )圖1華尼妙林和泰國妙抗生素的總離子流圖和選擇離子流圖fig.1 mrmchromatogramofvalnemulinandtiamulin (a ) tic、(b) valnemulin (c) tiamulin5.2.2質(zhì)量分析條件的優(yōu)化根據(jù)連翹酯和連翹酯的結(jié)構(gòu)特

10、征選擇esi ()作為電離模式，分別取1.0mg/l的連翹酯標(biāo)準(zhǔn)溶液和連翹酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，以5l/min的流速注入離子源，確定了定性、定量離子對，同時確定了團(tuán)簇電壓(dp )、聚焦由可知，泰霉素準(zhǔn)分子離子m h為m/z 494.3，對其子離子進(jìn)行全掃描，主要產(chǎn)生m/z 192.1、119.0的子離子的圖2(b )的石墨烯的準(zhǔn)分子離子m h為m/z 565.3 因此，沃尼妙林和泰妙菌的碎片離子可能的破壞方式如圖3所示。 選擇2個響應(yīng)強的子離子作為監(jiān)視器的碎片離子，將其中響應(yīng)值高的子離子用于定量修正計算。(a )(b )圖2離子模式下的沃尼妙林和泰國妙抗生素的掃描質(zhì)量分析圖fig.2 masspect

11、raofvalnemulinandtiamulininpositivemode (a )價值觀(b ) tia mulin圖3沃尼妙林和泰國妙抗生素碎片離子破壞方式fig.3 majorfragmentionsofvalnemulinandtiamulininpositivemode最終選擇質(zhì)量分析條件：離子源：電噴霧離子源電離方式：正離子模式檢查方式：多反應(yīng)監(jiān)測(mrm )電噴霧電壓(is):5 000 v； 霧化氣體(neb )壓力：0.5mpa； 氣幕氣體(cur )壓力：0.35mpa； 輔助氣體(aux )壓力：0.7mpa； 輔助氣體溫度(tem):550； 沖擊室出口電壓(cxp

12、):13v； 聚焦電壓(fp):150 v； 監(jiān)測離子對、采集時間、保持時間、脫簇電壓和碰撞能如表2所示。tab.2 esi-ms/msanalysisconditionsofvalnemulinandtiamulin化合物定性離子對/(m/z )定量離子對/(m/z )采集時間/(毫秒)保持時間/min脫簇電壓dp/(v )碰撞能量ce/(v )泰特辛494.30/192.10494.30/192.10801.9823425494.30/119.0038沃尼妙林565.30/263.10565.30/263.10802.0910025565.30/285.20295. 3定量方式的選擇外標(biāo)法

13、定量：在儀器的最佳工作條件下，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)溶液的樣品測定，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對測定樣品進(jìn)行定量，樣品溶液中被測物的響應(yīng)值必須在儀器測定的線性范圍內(nèi)。六、方法的主要技術(shù)指標(biāo)6.1線性范圍和測量下限沃尼妙林的線性范圍為1.0-200.0ug/kg，相關(guān)系數(shù)為r=0. 999 4，其回歸方程為y=9.17105 x 11500，具有良好的線性關(guān)系，滿足定量要求。 細(xì)胞嘧啶的線性范圍為1.0-200.0ug/kg，相關(guān)系數(shù)為r=0. 999 8，其回歸公式為y=7.04105 x 25800，具有良好的線性關(guān)系，滿足定量要求。當(dāng)茶堿和茶堿的

14、加入均為5.0ug/kg時，其信噪比均大于10，得到了良好的回收率和精密度，由此證實本標(biāo)準(zhǔn)煙曲霉菌的檢測限于5.0ug/kg。6.2方法的回收率和精度用陰性雞肉、魚肉、豬肝、雞蛋和牛奶樣品進(jìn)行添加回收和精密度試驗，樣品中添加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)后，用本方法進(jìn)行提取、凈化和測定，各添加水平重復(fù)10次，沃尼妙林和泰國抗生素的添加量均為5.0、10.0、50.0和100.0 ug 4個添加水平的回收率在72.40%106.20 %之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.71%11.90%之間，方法的回收率和精度良好。6.3方法的驗證結(jié)果本標(biāo)準(zhǔn)方法在5個實驗室驗證實驗方法，實驗結(jié)果如表5、表6所示。七.結(jié)論綜上所述，本標(biāo)準(zhǔn)能

15、夠滿足動物組織、內(nèi)臟、魚、蛋和乳中沃尼奇林及其同系物泰國偉大抗生素殘留量的測定分析。 方法：各項技術(shù)指標(biāo)均符合基本規(guī)定的要求，可以滿足進(jìn)出口動物源性食品中沃尼好林及其同系物泰國好抗生素殘留量的檢驗要求。表3雞肉、魚肉、豬肝、雞蛋和牛奶樣品中沃尼妙林添加回收率和精密度的實驗數(shù)據(jù)雞肉魚肉豬肝雞蛋牛奶添加值(g/kg )5105010051050100510501005105010051050100測定值(g/kg )4.128.9145.3494.674.039.2542.3688.654.679.2439.6687.244.269.2438.5689.244.878.2242.6381.264.078.3249.8990.544.578.7347.8282.763.768.2345.7385.363.788.5844.6986.353.929.4338.7484.394.038.7443.7395.323.749.5639.5293.753.899.3342.1594.713.879.6547.2594.363.837.8643.5577.883.877.8544.8587.214.637.8144.8990.234.217.4747.6382.334.678.21