1、實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一微生物制片及形態(tài)觀察微生物制片及形態(tài)觀察 一、細(xì)菌簡(jiǎn)單染色法及形態(tài)觀察一、細(xì)菌簡(jiǎn)單染色法及形態(tài)觀察 （一）基本原理（一）基本原理 簡(jiǎn)單染色法是利用單一染料對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色的一種方法。此法操作簡(jiǎn)便，適用于菌絲體一般形狀和細(xì) 菌排列的觀察。 常用堿性染料進(jìn)行簡(jiǎn)單染色，這是因?yàn)椋涸谥行浴A性或弱酸性溶液中，細(xì)菌細(xì)胞通常帶負(fù)電荷，而 堿性染料在電離時(shí)，其分子的染色部分帶正電荷（酸性染料帶負(fù)電荷） ，因此堿性染料的染色部分很容易與 細(xì)菌結(jié)合使細(xì)菌著色。 經(jīng)染色后的細(xì)菌細(xì)胞與背景形成鮮明的對(duì)比，在顯微鏡下更易于識(shí)別。常用作簡(jiǎn)單染色的染料有美藍(lán)、 結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅等。 當(dāng)細(xì)菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基p

2、H 下降時(shí)，細(xì)菌所帶正電荷增加，此時(shí)可用伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅等 酸性染料染色。 （二）實(shí)驗(yàn)材料（二）實(shí)驗(yàn)材料 1 1菌種：菌種：大腸桿菌、酵母菌的斜面培養(yǎng)物。 2 2染色劑：染色劑：呂氏堿性美藍(lán)、草酸銨結(jié)晶紫等。 3 3儀器或其它用具：儀器或其它用具：顯微鏡，酒精燈，載玻片，接種環(huán)，雙層瓶，擦鏡紙等。 （三）實(shí)驗(yàn)步驟（三）實(shí)驗(yàn)步驟 1. 1. 涂片：涂片：取一塊載玻片，滴一小滴蒸餾水于玻片中央，用接環(huán)以無(wú)菌操作的方法，從菌種斜面上挑取 少許菌苔于水滴中，混勻，并涂成薄膜。涂片要涂抹均勻，不宜過(guò)厚。 2. 2. 干燥：干燥：室溫自然干燥或烘干。 3. 3. 固定：固定：涂面朝上，通過(guò)火焰 23

3、 次。 此操作過(guò)程稱熱固定，其目的是使細(xì)胞質(zhì)凝固，以固定細(xì)胞形態(tài)，并使之牢固附著在載玻片上；同時(shí) 還可以殺死菌體；增加菌體與染料的結(jié)合力。熱固定溫度不宜過(guò)高（以玻片背面不燙手為宜） ，否則會(huì)改變 甚至破壞細(xì)胞形態(tài)。 4. 4. 染色：染色：將玻片平放于玻片擱架上，滴加12 滴染液于涂片上。草酸銨結(jié)晶紫染色約1 min；若用呂氏 堿性美藍(lán)、或石炭酸復(fù)紅染色12 min。 5. 5. 水洗：水洗：倒去染液，用自來(lái)水沖洗，直至涂片上流下的水無(wú)色為止。水洗時(shí)，不要直接用水沖洗涂面， 而應(yīng)使水從載玻片的一端經(jīng)涂面流向另一端，水流不宜過(guò)急過(guò)大，以免涂片薄膜脫落。 6. 6. 干燥：干燥：自然干燥，或用吸水

4、紙吸干，也可烘干。 7. 7. 鏡檢：鏡檢：涂片干后鏡檢。涂片必須完全干燥后才能用油鏡觀察。 （四）實(shí)驗(yàn)報(bào)告內(nèi)容（四）實(shí)驗(yàn)報(bào)告內(nèi)容 根據(jù)觀察結(jié)果，繪出所觀察細(xì)菌的形態(tài)圖。 二、革蘭氏染色法二、革蘭氏染色法 （一）基本原理（一）基本原理 革蘭氏染色法將細(xì)菌分為革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性，是由這兩類細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不同決定的。實(shí) 際上，當(dāng)用結(jié)晶紫初染后，像簡(jiǎn)單染色法一樣，所有細(xì)菌都被染成初染劑的藍(lán)紫色。碘作為媒染劑，它能 與結(jié)晶紫結(jié)合成結(jié)晶紫碘的復(fù)合物，從而增強(qiáng)了染料與細(xì)菌的結(jié)合力。當(dāng)用脫色劑處理時(shí)，兩類細(xì)菌的 脫色效果不同的。革培養(yǎng)氏陽(yáng)性細(xì)菌，細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成、壁厚、類脂質(zhì)含量

5、低， 用乙醇（或丙酮）脫色時(shí)細(xì)胞壁脫水、使肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮小，透性降低，從而使結(jié)晶紫碘 的復(fù)合物不易被洗脫而保留在細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)脫色和復(fù)染后仍保留初染劑的藍(lán)紫色。而革蘭氏陰性菌：細(xì)胞壁 肽聚糖層較薄、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)交聯(lián)少，且類脂質(zhì)含量較高，經(jīng)乙醇處理后，類脂質(zhì)被溶解，細(xì)胞壁孔徑變大， 通透性增加，結(jié)晶紫碘的復(fù)合物被溶出細(xì)胞壁，細(xì)胞被脫色，復(fù)染后，細(xì)胞被染上復(fù)染劑的顏色。 （二）實(shí)驗(yàn)材料（二）實(shí)驗(yàn)材料 1 1菌種：菌種：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的斜面培養(yǎng)物。 2 2染色劑：染色劑：革蘭氏染色液。 3 3儀器或其他用具同實(shí)驗(yàn)一。儀器或其他用具同實(shí)驗(yàn)一。 （三）實(shí)驗(yàn)步驟（三）實(shí)驗(yàn)步驟 1 1制片：制

6、片：取菌種培養(yǎng)物按常規(guī)涂片、干燥、固定。 不宜過(guò)熱（以玻片不燙手為宜） 。 2 2初染：初染：滴加結(jié)晶紫（以剛好將菌膜覆蓋為宜）染色2 min。 3 3媒染：媒染：先用水沖去染色液，再用滴加碘液覆蓋約1 min。 4 4脫色：脫色：將載玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脫色，直至流出的乙醇無(wú)紫色時(shí)，立 即水洗。 革蘭氏染色結(jié)果是否正確，乙醇脫色是革蘭氏染色操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。脫色不足，陰性菌被誤染成 陽(yáng)性菌，脫色過(guò)度，陽(yáng)性菌被誤染成陰性菌。脫色時(shí)間一般約2030 s。 5 5復(fù)染：復(fù)染：用蕃紅液復(fù)染約 2 min，水洗。 6 6鏡檢：鏡檢：干燥后，用油鏡觀察。菌體被染成藍(lán)色的是革蘭氏陽(yáng)

7、性菌，被成紅色的為革蘭氏陰性菌。 混合涂片染色：混合涂片染色：按上述方法，在同一載玻片上，以大腸桿菌和金黃色葡萄菌作混合涂片進(jìn)行比較。 （四）實(shí)驗(yàn)報(bào)告內(nèi)容（四）實(shí)驗(yàn)報(bào)告內(nèi)容 根據(jù)觀察結(jié)果，繪出所觀察細(xì)菌的形態(tài)圖。 要用活躍生長(zhǎng)期的幼齡培養(yǎng)物作革蘭氏染色；涂片不宜過(guò)厚，以免脫色不完全造成假陽(yáng)性；火焰固定 三、細(xì)菌的芽孢染色三、細(xì)菌的芽孢染色 （一）基本原理（一）基本原理 芽孢又叫內(nèi)生孢子是某些細(xì)菌生長(zhǎng)到一定階段在菌體內(nèi)形成的休眠體，通常呈圓形或橢圓形。細(xì)菌能 否形成芽孢以及芽孢的形狀、芽孢在芽孢囊內(nèi)的位置以及芽孢囊是否膨大等特征是鑒定細(xì)菌的依據(jù)之一。 由于芽孢壁厚、透性低、不易著色，當(dāng)用石炭酸復(fù)

8、紅、結(jié)晶紫等進(jìn)行簡(jiǎn)單染色時(shí)，菌體和芽孢囊著色， 而芽孢囊內(nèi)的芽孢不著色或僅顯很淡的顏色，游離的芽孢呈淡紅或淡藍(lán)紫色的圓或椰圓形的圈。為了使芽 2 / 14 孢著色便于觀察，可用芽孢染色法。 芽孢染色是用著色力強(qiáng)的染色劑孔雀綠或石炭酸復(fù)紅，在加熱條件下染色，使染料不僅進(jìn)入菌體也可 進(jìn)入芽孢內(nèi)，進(jìn)入菌體的染料經(jīng)水洗后被脫色，而芽孢一經(jīng)著色難以被水洗脫，當(dāng)用對(duì)比度大的復(fù)染劑染 色后，芽孢仍保留初染劑的顏色，而菌體和芽孢囊被染成復(fù)染劑的顏色，使芽孢和菌體更易于區(qū)分。 （二）實(shí)驗(yàn)材料（二）實(shí)驗(yàn)材料 1 1菌種：菌種：枯草芽孢桿菌的斜面培養(yǎng)物。 2 2染色劑：染色劑：5%孔雀綠溶液，0.5%蕃紅水溶液。

9、3 3儀器或其它用具：儀器或其它用具：小試管，滴管，燒杯、試管架，載玻片，木夾子，顯微鏡等。 （三）實(shí)驗(yàn)步驟（三）實(shí)驗(yàn)步驟 1. 1. 制片：制片：按常規(guī)涂片、干燥、固定。 2. 2. 染色：染色：加數(shù)滴孔雀綠染液于片上，用木夾夾住載玻片一端，在微火上加熱至染料冒蒸氣并開始計(jì)時(shí)， 維持 5 min。加熱過(guò)程中，要及時(shí)補(bǔ)充染液，切勿讓涂片干涸。 3. 3. 水洗：水洗：待玻片冷卻后，用自來(lái)水沖洗，直至流出的水無(wú)色為止。 4. 4. 復(fù)染：復(fù)染：用番紅染液復(fù)染 2 min 。 5. 5. 水洗：水洗：水洗后，吸干。 6. 6. 鏡檢：鏡檢：從低倍鏡到高倍鏡，最后用油鏡觀察。芽孢呈綠色，芽孢囊及營(yíng)養(yǎng)

10、體為紅色。 （四）實(shí)驗(yàn)報(bào)告內(nèi)容（四）實(shí)驗(yàn)報(bào)告內(nèi)容 根據(jù)觀察結(jié)果，繪出所觀察細(xì)菌的形態(tài)圖。 四、酵母菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察四、酵母菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 （一）基本原理（一）基本原理 在光學(xué)顯微鏡下， 大多數(shù)酵母菌為單細(xì)胞， 一般呈卵圓形、 圓形、 圓柱形或檸檬形。 大小約為 155 30 m、 ，最大可達(dá) 100 m。各種酵母菌有其一定的大小和形態(tài)，但也隨菌齡和環(huán)境條件而異；即使在純培 養(yǎng)中，各個(gè)細(xì)胞的形狀、大小亦有差別。有些酵母菌細(xì)胞與其子代細(xì)胞連在一起成為鏈狀，成為假絲酵母。 大多數(shù)酵母在平板培養(yǎng)基上形成的菌落較大而厚，濕潤(rùn)、較光滑，顏色較單調(diào)（多為乳白色，少有紅色， 偶見(jiàn)黑色） 。酵母細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)

11、有明顯的分化，個(gè)體直徑比細(xì)菌大幾倍到十幾倍。繁殖方式也較復(fù)雜，無(wú) 性繁殖主要是出芽生殖或裂殖， ，有些酵母能形成假菌絲。有性繁殖是通過(guò)接合形成子囊及子囊孢子。 （二）實(shí)驗(yàn)材料（二）實(shí)驗(yàn)材料 1 1菌種：菌種：釀酒酵母。 2 2染液及溶液：染液及溶液：蕃紅染液。 3 3其它物品：其它物品：載玻片及蓋玻片等。 （三）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（三）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 個(gè)體形態(tài)特征與出芽繁殖的觀察：個(gè)體形態(tài)特征與出芽繁殖的觀察： 酵母細(xì)胞較大，用水浸片法觀察，即在載玻片中央滴加一滴水，滴加一小滴蕃紅液，用接種環(huán)取釀酒 3 / 14 酵母少許（并注意酵母菌與培養(yǎng)基結(jié)合是否緊密） ，置于水與蕃紅的混合液中，制成菌懸液。將蓋玻片斜置

12、 輕輕蓋在液滴上。先用低倍鏡，再換高倍鏡觀察酵母細(xì)胞的形狀。 （四）實(shí)驗(yàn)報(bào)告內(nèi)容（四）實(shí)驗(yàn)報(bào)告內(nèi)容 根據(jù)觀察結(jié)果，繪出所觀察菌體的形態(tài)圖。 實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二微生物顯微計(jì)數(shù)微生物顯微計(jì)數(shù) （一）實(shí)驗(yàn)原理（一）實(shí)驗(yàn)原理 利用血球計(jì)數(shù)器在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)是一種常見(jiàn)的微生物計(jì)總數(shù)的方法。因?yàn)橛?jì)數(shù)器載片和蓋片間的 容積一定，所以可以根據(jù)顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來(lái)計(jì)算單位體積內(nèi)微生物總數(shù)。 血球計(jì)數(shù)器是一只特制載玻片。載片上有兩個(gè)方格網(wǎng)，每一方格網(wǎng)共分九個(gè)大方格，其中間的一個(gè)大 方格用來(lái)做微生物計(jì)數(shù)，所以又稱為計(jì)數(shù)室。計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種，一種是每個(gè)大方格分成16 個(gè)中方 格，每中方格又分成 25 個(gè)小方

13、格（麥?zhǔn)涎?xì)胞計(jì)數(shù)板）。另一種是一個(gè)大方格分25 個(gè)中方格，每個(gè)中方 格又分成 16 個(gè)小方格（希里格血細(xì)胞計(jì)數(shù)板。但是不論哪一種，一個(gè)大方格，都等分成（2516 或 16 25）400 個(gè)小方格。因?yàn)槊總€(gè)大方格邊長(zhǎng)為1 mm，載片與蓋片間距離為 0.1 mm，所以每個(gè)計(jì)數(shù)室（1 個(gè)大 方格）體積為0.1 mm3。測(cè)出每個(gè)中方格菌數(shù)，就可以算出一個(gè)大方格的菌數(shù)，由此推算出每毫升菌液內(nèi)所 含的菌數(shù)。 （二）實(shí)驗(yàn)材料（二）實(shí)驗(yàn)材料 1. 1. 器材：器材：血球計(jì)數(shù)板、顯微鏡。 2. 2. 菌種：菌種：釀酒酵母菌液。 （三）操作步驟（三）操作步驟 1. 1. 血球計(jì)數(shù)板的操作血球計(jì)數(shù)板的操作 1）取

14、一個(gè)清潔的血球計(jì)數(shù)板，將潔凈的專用蓋玻片放置在計(jì)數(shù)室上； 2）把釀酒酵母菌懸液進(jìn)行稀釋，以每小格有35 個(gè)酵母菌為宜； 3）搖勻稀釋的酵母菌液，用無(wú)菌滴管吸取少許菌液，沿蓋玻片的邊緣滴一小滴（不宜太多） ，使菌液 自行滲入計(jì)數(shù)室（兩個(gè)計(jì)數(shù)室各滴一滴；注意：加菌液時(shí)不得使計(jì)數(shù)室內(nèi)有氣泡） ，靜置 5 min； 4）將計(jì)數(shù)板放置在顯微鏡的載物臺(tái)上， 先在低倍鏡下找到方格網(wǎng)， 然后轉(zhuǎn)到高倍鏡下進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。 2. 2. 計(jì)數(shù)方法計(jì)數(shù)方法 1）不同規(guī)格的計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)方法略有差異，一個(gè)大方格是 16 個(gè)中方格的（1625），應(yīng)當(dāng)數(shù) 4 角 4 個(gè)中方格（即 100 個(gè)小方格）的菌數(shù)；一個(gè)大方格是25

15、個(gè)中方格的（2516），除取 4 角 4 個(gè)中方格外， 還要數(shù)中央一個(gè)中方格（即為80 個(gè)小方格）的菌數(shù)。注意：酵母菌的芽體達(dá)到母體細(xì)胞大小的一半者，即 可作為兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)；位于兩個(gè)中方格間線上的酵母菌，只統(tǒng)計(jì)此格的上側(cè)和右側(cè)線上的菌體數(shù)，即數(shù)上 不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右； 2）每個(gè)樣品重復(fù)（需重新加樣）計(jì)數(shù) 23 次（每次計(jì)數(shù)結(jié)果不應(yīng)相差太大，否則重新操作），求平 均值； 3）按下列公式計(jì)算出每毫升菌液所含的酵母菌細(xì)胞數(shù)； 4 / 14 總菌數(shù) / ml 80個(gè)小方格內(nèi)菌數(shù) 400 10000 稀釋倍數(shù) 80 每小方格內(nèi)菌數(shù)4106稀釋倍數(shù) （四）實(shí)驗(yàn)報(bào)告內(nèi)容（四）實(shí)驗(yàn)報(bào)告內(nèi)容 記錄計(jì)數(shù)結(jié)果，并計(jì)

16、算出每毫升菌液中的酵母菌細(xì)胞數(shù)。 實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)三培養(yǎng)基配制及滅菌培養(yǎng)基配制及滅菌 一、培養(yǎng)基的常規(guī)配制程序一、培養(yǎng)基的常規(guī)配制程序 正確掌握培養(yǎng)基的配制方法是從事微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)工作的重要基礎(chǔ)。由于微生物種類及代謝類型的多樣 性，因而用于培養(yǎng)微生物培養(yǎng)基的種類也很多，它們的配方及配制方法雖各有差異。但一般培養(yǎng)基的配制 程序卻大致相同。 （一）實(shí)驗(yàn)材料（一）實(shí)驗(yàn)材料 1. 1. 藥品：藥品：待配各種培養(yǎng)基的組成成分、瓊脂、1 mol/L NaOH溶液、1 mol/L HCl溶液等。 2. 2. 儀器：儀器：天平或臺(tái)秤、高壓蒸汽滅菌鍋。 3. 3. 玻璃器皿：玻璃器皿：移液管、試管、燒杯、量筒、錐形瓶、

17、培養(yǎng)皿、玻璃漏斗等。 4. 4. 其它物品：其它物品：藥匙、稱量紙、pH 試紙、記號(hào)筆、棉花、紗布、線繩、塑料試管蓋、報(bào)紙等。 （二）實(shí)驗(yàn)步驟（二）實(shí)驗(yàn)步驟 1. 1. 玻璃器皿的洗滌玻璃器皿的洗滌 玻璃器皿在使用前必須洗刷干凈。將錐形瓶、試管、培養(yǎng)皿、量筒等浸入含有洗滌劑的水中，用毛刷 刷洗，然后用自來(lái)水及蒸餾水沖凈。移液管先用含有洗滌劑的水浸泡，再用自來(lái)水及蒸餾水沖洗。洗刷干 凈的玻璃器皿置于烘箱中烘干后備用。詳見(jiàn)附錄一。 2. 2. 滅菌前玻璃器皿的包裝滅菌前玻璃器皿的包裝 (1) 培養(yǎng)皿的包裝：培養(yǎng)皿由一蓋一底組成一套?？捎脠?bào)紙將幾套培養(yǎng)皿包成一包，或者將幾套培養(yǎng)皿 直接置于特制的鐵皮

18、圓筒內(nèi)，加蓋滅菌。包裝后的培養(yǎng)皿須經(jīng)滅菌之后才能使用。 (2) 移液管的包裝：在移液管的上端塞入一小段棉花(勿用脫脂棉)，它的作用是避免外界及口中雜菌吹 入管內(nèi)，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花應(yīng)距管口約0.5 cm 左右，棉花自身長(zhǎng)度約11.5 cm。塞 棉花時(shí)，可用一外圈拉直的回形針，將少許棉花塞入管口內(nèi)。棉花要塞得松緊適宜，吹時(shí)以能通氣而又不 使棉花滑下為準(zhǔn)。 先將牛皮紙或報(bào)紙裁成寬約5 cm 左右的長(zhǎng)紙條， 然后將已塞好棉花的移液管尖端放在長(zhǎng)條報(bào)紙的一端， 約成 45角，折迭紙條包住尖端，用左手握住移液管身，右手將移液管壓緊，在桌面上向前搓轉(zhuǎn)，以螺旋式 包扎起來(lái)。上端剩余紙條，折迭

19、打結(jié)，準(zhǔn)備滅菌。 3. 3. 液體及固體培養(yǎng)基的配制過(guò)程液體及固體培養(yǎng)基的配制過(guò)程 1）液體培養(yǎng)基配制 稱量：稱量：一般可用 1/l00 粗天平稱量配制培養(yǎng)基所需的各種藥品。先按培養(yǎng)基配方計(jì)算各成分的用量，然 后進(jìn)行準(zhǔn)確稱量。稱牛肉膏、蛋白胨時(shí)要用小燒杯進(jìn)行稱量。 5 / 14 溶化：溶化：將稱好的藥品置于一燒杯中，先加入少量水(根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要可用自來(lái)水或蒸餾水)，用玻棒攪動(dòng)， 加熱溶化。 定容：定容：待全部藥品溶化后，倒入搪瓷杯中，加水至所需體積。如某種藥品用量太少時(shí)，可預(yù)先配成較 濃溶液，然后按比例吸取一定體積的溶液，加入到培養(yǎng)基中。 調(diào)調(diào) pHpH：一般用 pH 試紙測(cè)定培養(yǎng)基的 pH。用

20、剪刀剪取一小段 pH 試紙，然后用鑷子夾住 pH 試紙，在 培養(yǎng)基中蘸一下，觀看其 pH 范圍，如培養(yǎng)基偏酸或偏堿時(shí)，可用 1 mol/L NaOH或 1 mol/L HCl溶液進(jìn)行調(diào) 節(jié)。調(diào)節(jié) pH 時(shí)，應(yīng)逐滴加入NaOH 或 HCl 溶液，防止局部過(guò)酸或過(guò)堿，破壞培養(yǎng)基中成分；邊加邊攪拌， 并不時(shí)用 pH 試紙測(cè)試，直至達(dá)到所需pH 為止。 過(guò)濾：過(guò)濾：用濾紙或多層紗布過(guò)濾培養(yǎng)基。一般無(wú)特殊要求時(shí)，此步可省去。 2）固體培養(yǎng)基的配制 配制固體培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)將已配好的液體培養(yǎng)基加熱煮沸，再將稱好的瓊脂(1.52)加入，并用玻棒 不斷攪拌，以免糊底燒焦。繼續(xù)加熱至瓊脂全部融化，最后補(bǔ)足因蒸發(fā)而失

21、去的水分。 4. 4. 培養(yǎng)基的分裝培養(yǎng)基的分裝 根據(jù)不同需要，可將已配好培養(yǎng)基裝入試管或錐形瓶?jī)?nèi)，分裝時(shí)注意不要使培養(yǎng)基沾污管口或瓶口， 造成污染。如操作不小心，培養(yǎng)基沾污管口或瓶口時(shí)，可用鑷子夾一小塊脫脂棉或卷紙，擦去管口或瓶口 的培養(yǎng)基。 1）試管的分裝 取一個(gè)玻璃漏斗，裝在鐵架上，漏斗下連一根橡皮管，橡皮管下端再與另一玻璃管相接，橡皮管的中 部加一彈簧夾。分裝時(shí)，用左手拿住空試管中部，并將漏斗下的玻璃管嘴插入試管內(nèi)，以右手拇指及食指 開放彈簧夾，中指及無(wú)名指夾住玻璃管嘴，使培養(yǎng)基直接流入試管內(nèi)。 裝入試管培養(yǎng)基的量視試管大小及需要而定， 若所用試管大小為 15150 mm 時(shí)，液體培養(yǎng)

22、基可分裝至 試管高度 l/4 左右為宜；如分裝固體或半固體培養(yǎng)基時(shí)，在瓊脂完全融化后，應(yīng)趁熱分裝于試管中；用于制 作斜面的固體培養(yǎng)基的分裝量為管高1/3 (約 10 m1)；半固體培養(yǎng)基分裝量為管高的1/3 為宜。 2）錐形瓶的分裝 用于振蕩培養(yǎng)微生物用時(shí)，可在250 m1 錐形瓶中加入 50 m1 的液體培養(yǎng)基；若用于制作平板培養(yǎng)基用 時(shí)，可在 250 ml 錐形瓶中加入 150 m1 液體培養(yǎng)基，然后再加入3 g 瓊脂粉(按 2計(jì)算)，滅菌時(shí)瓶中瓊脂 同時(shí)被融化。 5. 5. 棉塞的制作及試管、錐形瓶的包扎棉塞的制作及試管、錐形瓶的包扎 為了培養(yǎng)好氣性微生物，需提供優(yōu)良通氣條件，同時(shí)為防止

23、雜菌污染，則必須對(duì)通入試管或錐形瓶?jī)?nèi) 空氣預(yù)先進(jìn)行過(guò)濾除菌。通常方法是在試管及錐形瓶口加上棉花塞等。 1）試管棉塞的制作 制棉塞時(shí)，應(yīng)選用大小、厚薄適中的普通棉花一塊，鋪展于左手拇指和食指扣成的圓孔上，用右手食 指將棉花從中央壓入圓孔中制成棉塞，然后直接壓入試管或錐形瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折迭 卷塞法制作棉塞。 制作的棉塞應(yīng)緊貼管壁，不留縫隙，以防外界微生物沿縫隙侵入，棉塞不宜過(guò)緊或過(guò)松，塞好后以手 提棉塞，試管不下落為準(zhǔn)。棉塞的2/3 在試管內(nèi)，1/3 在試管外。目前也有采用金屬或塑料試管帽代替棉塞， 直接蓋在試管口上，滅菌待用。將裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或蓋好管帽的試管捆成一捆，外面

24、包上一層牛皮 紙。用鉛筆注明培養(yǎng)基名稱及配制日期。滅菌待用。 2）錐形瓶棉塞制作 通常在棉塞外包上一層紗布，再塞在瓶口上。有時(shí)為了進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)加大通氣量，則可用 8 層紗 6 / 14 布代替棉塞包在瓶口上。目前也有采用無(wú)菌培養(yǎng)容器封口膜直接蓋在瓶口上，既保證良好通氣，過(guò)濾除菌 又操作簡(jiǎn)便，故極受歡迎。 在裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或包上八層紗布或蓋好培養(yǎng)容器封口膜的錐形瓶口上，再包上一層牛皮紙并 用線繩捆好，滅菌待用。 6. 6. 培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基的滅菌 培養(yǎng)基經(jīng)分裝包扎之后，應(yīng)立即進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，121滅菌 15 min。如因特殊情況不能及時(shí)滅菌， 則應(yīng)暫存于冰箱中。 7. 7. 斜面和

25、平板的制作斜面和平板的制作 1）斜面的制作 將已滅菌裝有固體培養(yǎng)基的試管，趁熱置于木棒上，使成適當(dāng)斜度，凝固后即成斜面。斜面長(zhǎng)度為試 管長(zhǎng)度 1/3，底層長(zhǎng)為試管的 2/3。如制作半固體或固體深層培養(yǎng)基時(shí)，滅菌后則應(yīng)垂直放置至冷凝。 2）平板的制作 將裝在錐形瓶中已滅菌的固體培養(yǎng)基融化后，待冷至 60左右傾入無(wú)菌培養(yǎng)皿中。冷凝后即成平板。 倒平板時(shí)，培養(yǎng)基溫度過(guò)高，皿蓋上的冷凝水太多；溫度低于45，培養(yǎng)基易于凝固而無(wú)法制作平板。 8. 8. 培養(yǎng)基的無(wú)菌檢查培養(yǎng)基的無(wú)菌檢查 滅菌后的培養(yǎng)基，一般需進(jìn)行無(wú)菌檢查。最好從中取出 12 管(瓶)，置于 37溫箱中培養(yǎng) 12d，確 定無(wú)菌后方可使用。

26、二、細(xì)菌、放線菌常用培養(yǎng)基的配制二、細(xì)菌、放線菌常用培養(yǎng)基的配制 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種廣泛用于培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基，屬于半合成培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的 主要成分是牛肉膏、蛋白胨和NaCl。而 LB 培養(yǎng)基的主要成分是胰化蛋白胨、酵母提取物和NaCl。它們分 別提供微生物生長(zhǎng)繁殖所需要的碳源、氮源、能源、生長(zhǎng)因子和無(wú)機(jī)鹽等。培養(yǎng)基都是水溶液，這是因?yàn)?一切生物細(xì)胞都必須要水，蒸餾水不含雜質(zhì)，比自來(lái)水好，特別是配制合成培養(yǎng)基時(shí)都必須用蒸餾水，配 天然培養(yǎng)基時(shí)可用自來(lái)水，但自來(lái)水中常含Ca2+，Mg2+離子，易與其它成分形成沉淀。 高氏合成號(hào)培養(yǎng)基是一種用于培養(yǎng)放線菌的合成培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中的可溶

27、性淀粉作為碳源和能源， KNO3作為氮源，K2HPO4、MgSO4和 FeSO4為無(wú)機(jī)鹽等。 （一）實(shí)驗(yàn)材料（一）實(shí)驗(yàn)材料 1. 1. 藥品：藥品：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、可溶性淀粉、KNO3、K2HPO4、Mg2SO47H2O、FeSO47H2O 等。 2. 2. 溶液：溶液：1 mol/L NaOH、1 mol/L HCl。 3. 3. 儀器：儀器：天平、高壓蒸汽滅菌鍋。 4. 4. 玻璃器皿：玻璃器皿：移液管、試管、燒杯、量筒、錐形瓶、培養(yǎng)皿、玻璃漏斗等。 5. 5. 其它物品：其它物品：藥匙、pH 試紙、稱量紙、記號(hào)筆、棉花、紗布、線繩、塑料試管蓋、報(bào)紙等。 （二）實(shí)驗(yàn)步驟（二）實(shí)驗(yàn)

28、步驟 1. 1. 肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制 1）培養(yǎng)基成分：牛肉膏0.5 g，蛋白胨 1 g，NaCl 0.5 g，瓊脂 2 g，水 100 ml，pH 7.2。 2）配制方法 稱量及溶化：稱量及溶化：取一干凈小燒杯置于電子稱上，去皮，分別稱取蛋白胨和NaCl 的所需量，用玻棒挑取牛 7 / 14 肉膏刮于一小燒杯壁上，進(jìn)行稱量，然后加入少量蒸餾水，加熱溶化后倒入搪瓷杯中。將搪瓷杯置于電爐 上加熱，用玻棒攪拌，使藥品全部溶化。 定容定容：補(bǔ)充水量至所需體積。 調(diào)調(diào) pHpH：待溶液冷至室溫時(shí)，用1 mol/L NaOH溶液調(diào) pH 至 7.07.2。 加瓊脂：加瓊脂：加入所

29、需量的瓊脂，加熱融化，補(bǔ)充失水（亦可不用融化瓊脂，pH 調(diào)好后直接分裝后，將所 需瓊脂裝入三角瓶或試管中，注意瓊脂要沒(méi)入液體中，然后包扎滅菌） 。 分裝、加塞、包扎分裝、加塞、包扎。 高壓蒸汽滅菌：高壓蒸汽滅菌：121滅菌 15 min。 2. 2. 高氏合成號(hào)培養(yǎng)基的配制高氏合成號(hào)培養(yǎng)基的配制 1）培養(yǎng)基成分：可溶性淀粉2 g，KNO3 0.1g，K2HPO43H2O 0.05 g，NaCl 0.05 g，MgSO47H2O 0.05 g， FeSO47H2O 0.001 g，瓊脂 2 g，蒸餾水 100 ml，pH 7.27.4。 2）配制方法 稱量及溶化：稱量及溶化：用小燒杯稱量可溶性淀

30、粉，加入少量蒸餾水，將淀粉調(diào)成糊狀，置于電爐上加熱，邊加 熱邊攪拌至沸騰，使淀粉完全溶化。然后倒入搪瓷杯中，再加入所需水量的/左右。 分別稱量 KNO3、 NaCl、 K2HPO4和 MgSO4， 分別溶解后倒入上述搪瓷杯中。 按每 100 m1 培養(yǎng)基加入 1 FeSO4溶液 0.1 ml 的量加入 FeSO4。 定容定容：加水至所需體積。 調(diào)調(diào) pHpH：用 1mol/L NaOH溶液調(diào) pH 至 7.4。 加瓊脂：加瓊脂：加入所需重量的瓊脂，加熱融化，補(bǔ)充失水。 分裝、加塞、包扎分裝、加塞、包扎。 高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌：121滅菌 15 min。 三、酵母菌、霉菌常用培養(yǎng)基的配制三、

31、酵母菌、霉菌常用培養(yǎng)基的配制 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基被廣泛用于培養(yǎng)酵母菌和霉菌。馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基有時(shí)也可用于培養(yǎng)放線菌。 豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基也是培養(yǎng)酵母菌及霉菌的一種優(yōu)良培養(yǎng)。 培養(yǎng)基配方中出現(xiàn)的自然pH 系指培養(yǎng)基不經(jīng)酸、堿調(diào)節(jié)而自然呈現(xiàn)的pH。 （一）實(shí)驗(yàn)材料（一）實(shí)驗(yàn)材料 1. 1. 藥品：藥品：葡萄糖、瓊脂等。 2. 2. 儀器：儀器：天平、高壓蒸汽滅菌鍋。 3. 3. 玻璃器皿：玻璃器皿：移液管、試管、錐形瓶、燒杯、量筒、培養(yǎng)皿、玻璃漏斗等。 4. 4. 其它物品：其它物品：藥匙、pH 試紙、稱量紙、紗布、線繩、塑料試管蓋、報(bào)紙等。 （二）實(shí)驗(yàn)步驟二）實(shí)驗(yàn)步驟 1. 1. 馬鈴薯葡萄糖

32、培養(yǎng)基的配制馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的配制 1）培養(yǎng)基成分：馬鈴薯20 g，葡萄糖 2 g，瓊脂 2 g，水 100 m1，自然 pH。 2）配制方法 配制配制 2020馬鈴薯浸汁：馬鈴薯浸汁：稱取馬鈴薯 40 g，加水 300 ml，加熱煮沸 30 min，用紗布過(guò)濾，然后補(bǔ)足失水 8 / 14 至所需體積，即制成 20馬鈴薯汁。 配制：配制：每 100 ml 馬鈴薯浸汁加入 2 g 葡萄糖和 2 g 瓊脂，加熱溶化，并補(bǔ)足失水。 分裝、加塞、包扎分裝、加塞、包扎。 高壓蒸汽滅菌：高壓蒸汽滅菌：121滅菌 15 min。 2. 2. 豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基的配制豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基的配制 1）培養(yǎng)基成分

33、：黃豆芽10g，葡萄糖 5 g，瓊脂 2 g，水 100 ml，自然 pH。 2）配制方法 稱量溶化：稱量溶化：稱取新鮮黃豆芽 20 g，置于燒杯中，加水 300 ml，加熱煮沸 30 min，用紗布過(guò)濾，補(bǔ)足失 水，即制成 l0豆芽汁。 配制：配制：每 100 ml 10豆芽汁加入 5 g 葡萄糖和 2 g 瓊脂，加熱溶化，補(bǔ)足失水。 分裝、加塞、包扎分裝、加塞、包扎。 高壓蒸汽滅菌：高壓蒸汽滅菌：121滅菌 15 min。 （三）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（三）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 1. 配制下列固體培養(yǎng)基（200 ml） ，每組只配其中的一種培養(yǎng)基。 肉湯蛋白胨培養(yǎng)基、高氏號(hào)培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基、豆芽汁培養(yǎng)基（各組選

34、擇其中一種培養(yǎng)基進(jìn)各組選擇其中一種培養(yǎng)基進(jìn) 行配制行配制） 。 2. 分裝 3 支試管（每支約 10 ml） ，余 170 ml 裝入 250 ml 三角瓶?jī)?nèi)。 3. 包扎：10 套平皿、6 支（馬鈴薯培養(yǎng)基、豆芽汁培養(yǎng)基5 支）試管（裝入自來(lái)水 9 ml） 、1 ml 移液 管 6 支（馬鈴薯培養(yǎng)基、豆芽汁培養(yǎng)基5 支） 、三角涂布棒 2 支。 4. 以上物品在 121高溫蒸氣滅菌備用。 實(shí)驗(yàn)四實(shí)驗(yàn)四土壤微生物分離與純化土壤微生物分離與純化 土壤是微生物生活的大本營(yíng)，是尋找和發(fā)現(xiàn)有重要應(yīng)用潛力的微生物的主要菌源。不同土樣中各類微 生物數(shù)量不同，一般土壤中細(xì)菌數(shù)量最多；其次為放線菌和霉菌。一般

35、在較干燥、偏堿性、有機(jī)質(zhì)豐富的 土壤中放線菌數(shù)量較多；酵母菌在一般土壤中的數(shù)量較少，而在水果表皮、葡萄園、果園土中數(shù)量多些。 本次實(shí)驗(yàn)從土壤中分離細(xì)菌、放線菌和霉菌；自面肥或酒曲或果園土分離酵母菌。 （一）實(shí)驗(yàn)材料（一）實(shí)驗(yàn)材料 1. 1. 菌源菌源：土壤菌懸液。 2. 2. 培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏合成l 號(hào)培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基、豆芽汁培養(yǎng)基。 3. 3. 其它物品：其它物品：培養(yǎng)皿、移液管、玻璃涂棒、稱量紙、藥勺、橡皮頭等。 （二）實(shí)驗(yàn)步驟（二）實(shí)驗(yàn)步驟 本次實(shí)驗(yàn)采用涂布法。 1. 1. 制備土壤稀釋液制備土壤稀釋液：已制備。 2. 2. 倒平板：倒平板： 將已滅菌的培養(yǎng)基傾

36、注到10 個(gè)培養(yǎng)皿中， 待冷凝后即成平板。 在皿蓋上標(biāo)明稀釋度或編號(hào)。 9 / 14 3. 3. 梯度稀釋：梯度稀釋：按 10 倍稀釋法進(jìn)行稀釋分離，以制備10 第一步：制備土壤菌懸液； 第二步：取 6 支無(wú)菌水試管，按 10 110 6 6稀釋度為例，具體操作過(guò)程如下， 順序編號(hào)，放在試管架上； 第三步：吸取 1 m1 土壤菌懸液注入第一支盛有9 ml 無(wú)菌水試管中，一手拿試管，在另一手掌上反復(fù) 擊打振蕩 20 次以上，制成 101的土壤稀釋液； 1 2 第四步： 另取一支無(wú)菌取移液管， 從 10 用同法再制成 10 3、104、10 5 稀釋液試管內(nèi)吸出 1 m1 菌懸液， 加入到第二支裝

37、有 9 ml 無(wú) 土壤稀釋液。菌水試管中，反復(fù)敲打振蕩20 次，制成 10 、10 6 的土壤稀釋液。 圖圖 4 45 5梯度稀釋示意圖梯度稀釋示意圖 4. 4. 涂布法分離涂布法分離：用無(wú)菌移液管吸取 106稀釋度菌懸液 0.2 ml，滴加于相應(yīng)編號(hào)的培養(yǎng)基平板上，右手 持無(wú)菌玻璃涂棒，左手拿培養(yǎng)皿，并用拇指將皿蓋打開一條縫，在火焰旁或超凈臺(tái)上，右手持玻璃涂棒于 平板表面將菌液自平板中央均勻向四周涂布擴(kuò)散，切忌用力過(guò)猛將菌液直接推向平板邊緣或?qū)⑴囵B(yǎng)基劃破， 重復(fù)涂 3 皿。依此法將 10 5、10 4稀釋液各涂 3 皿。 5. 5.培養(yǎng)培養(yǎng)：涂布完畢，將平板倒置于恒溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)23d 后

38、觀察結(jié)果。 將用過(guò)的移液管沖洗后用來(lái)蘇爾水浸泡1h 滅菌后再洗滌。 6. 6. 微生物菌落計(jì)數(shù)微生物菌落計(jì)數(shù)( (平板菌落計(jì)數(shù)法平板菌落計(jì)數(shù)法) ) 含菌樣品的微生物經(jīng)稀釋分離培養(yǎng)后，每一個(gè)活菌細(xì)胞可以在平板上繁殖形成一個(gè)肉眼可見(jiàn)的菌落。 故可根據(jù)平板上菌落的數(shù)目，推算出每克（毫升）含菌樣品中所含的活菌總數(shù)。 每克（毫升）樣品中微生物的活細(xì)胞數(shù) 同一稀釋度3個(gè)平板上菌落平均數(shù)稀釋倍數(shù) 含菌樣品毫升數(shù) 一般由三個(gè)稀釋度計(jì)算出的每克（毫升）含菌樣品中的總活菌數(shù)和同一稀釋度出現(xiàn)的總活菌數(shù)均應(yīng)很 7. 7. 平板菌落形態(tài)及個(gè)體形態(tài)觀察平板菌落形態(tài)及個(gè)體形態(tài)觀察 10 / 14 接近，不同稀釋度平板上出

39、現(xiàn)的菌落數(shù)應(yīng)呈規(guī)律性地減少。如相差較大，表示操作不精確。 從不同平板上選擇不同類型菌落用肉眼觀察，區(qū)分細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌的菌落形態(tài)特征。并 用接種環(huán)挑菌，視其與基質(zhì)結(jié)合緊密程度。再用接種環(huán)挑取不同菌落制片，在顯微鏡下進(jìn)行個(gè)體形態(tài)觀察。 8. 8. 分離純化菌株轉(zhuǎn)接斜面（斜面接種）分離純化菌株轉(zhuǎn)接斜面（斜面接種） 在分離細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌的不同平板上選擇分離效果較好，認(rèn)為已經(jīng)純化的菌落各挑選一 個(gè)用接種環(huán)接種到斜面上。將細(xì)菌接種于肉膏蛋白胨斜面上，放線菌接種于高氏 1 號(hào)斜面上，酵母菌接種 于豆芽汁葡萄糖斜面上，霉菌接種于馬鈴薯葡萄糖斜面上。 貼好標(biāo)簽，在各自適宜的溫度下培養(yǎng)，培

40、養(yǎng)后觀察是否為純種。置冰箱保藏。 （三）實(shí)驗(yàn)報(bào)告內(nèi)容（三）實(shí)驗(yàn)報(bào)告內(nèi)容 計(jì)算你所分離的微生物平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果。 實(shí)驗(yàn)五實(shí)驗(yàn)五環(huán)境因素對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響環(huán)境因素對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響 （一）目的要求（一）目的要求 了解某些物理因素、化學(xué)因素和生物因素對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響及芽孢對(duì)不良環(huán)境的抵抗能力。 （二）基本原理（二）基本原理 環(huán)境因素(包括物理因素、化學(xué)因素和生物因素)，如溫度、滲透壓、紫外線、 pH、氧氣、某些化學(xué)藥品 及拮抗菌等對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖、生理生化過(guò)程產(chǎn)生影響。不良的環(huán)境條件使微生物的生長(zhǎng)受到抑制，甚 至導(dǎo)致菌體的死亡。但是某些微生物產(chǎn)生的芽孢，對(duì)惡劣的環(huán)境條件有較強(qiáng)的抵抗能力。我們可以

41、通過(guò)控 制環(huán)境條件，使有害微生物的生長(zhǎng)繁殖受到抑制，甚至被殺死；而使有益微生物得到發(fā)展。 （三）實(shí)驗(yàn)材料（三）實(shí)驗(yàn)材料 1. 1. 菌種：菌種：金黃色葡萄球菌。 2. 2. 培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。 3. 3. 其它物品：其它物品：培養(yǎng)皿、無(wú)菌圓濾紙片、鑷子、無(wú)菌水、無(wú)菌滴管、水浴鍋。 4. 4. 藥品：藥品：1%新潔爾滅、5%來(lái)蘇兒水、10%青霉素、40%甲醛和 75%乙醇。 （四）實(shí)驗(yàn)步驟（四）實(shí)驗(yàn)步驟 1. 1.微生物檢查：微生物檢查： 將 100 ml 培養(yǎng)基融化后，倒 4 個(gè)平板，每皿約 2525 mlml 培養(yǎng)基，冷卻。檢查紙幣、手指、空氣及咳嗽中 的微生物，至 37恒溫

42、培養(yǎng)。 2. 2. 理化因素對(duì)微生物的影響：理化因素對(duì)微生物的影響： (1) 取 5 個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿，在皿底寫明測(cè)試藥品名稱。 (2) 將 100 ml 肉膏蛋白胨培養(yǎng)基融化，并冷卻至50左右后加入 2 ml 金黃色葡萄球菌菌懸液，迅速混 勻，傾入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每皿約20 ml，倒 5 皿，冷凝，即制成含菌平板。 (3) 將鑷子在酒精燈上灼燒后取分別浸泡在 1%新潔爾滅、5%來(lái)蘇兒水、10%青霉素、40%甲醛和 75% 乙醇藥品溶液中的濾紙片各一片，置于含菌平板的中央。 11 / 14 (4) 將平板倒置于 37溫箱中，培養(yǎng) 24h 后觀察結(jié)果，測(cè)量并記錄抑菌圈的直徑。根據(jù)其直徑的大小， 可初步

43、確定測(cè)試藥品的抑菌效能。 實(shí)驗(yàn)六實(shí)驗(yàn)六深層培養(yǎng)生產(chǎn)深層培養(yǎng)生產(chǎn)- -淀粉酶及其酶活測(cè)定淀粉酶及其酶活測(cè)定 枯草桿菌細(xì)胞為桿狀，能產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶等，因而可以液化明膠、水解干酪素、糖化淀粉；一般 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)茂盛，菌落為蔓延性，灰白、淡黃至黃色，少數(shù)為黑色，細(xì)皺或折迭。在 5056時(shí)能生長(zhǎng)， 適溫 3037。為需氧菌。存在于土壤、枯草中。 在培養(yǎng)基中加入淀粉，可以刺激枯草芽孢桿菌產(chǎn)生 -淀粉酶來(lái)分解培養(yǎng)基中的淀粉，以滿足其生長(zhǎng)所 需要的養(yǎng)分。由于微生物的多樣性，其代謝能力不盡相同，利用同一種微生物對(duì)同一種物質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵，通 過(guò)酶活力檢測(cè)，即可挑選出優(yōu)良菌株，或是改進(jìn)發(fā)酵工藝。 （一）實(shí)驗(yàn)材料（一

44、）實(shí)驗(yàn)材料 1. 1. 菌種：菌種：枯草芽孢桿菌（產(chǎn) -淀粉酶） 。 2. 2. 液體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基：細(xì)菌用培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）+ 0.5%淀粉。 3. 3. 試劑：試劑：碘液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH 6.0） 。 4. 4. 其它器皿：其它器皿：250 ml 三角瓶、小試管、移液管、白瓷板、搖床、離心機(jī)、水浴鍋。 （二）實(shí)驗(yàn)方法（二）實(shí)驗(yàn)方法 1. 1. 發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng) 1）配制液體培養(yǎng)基 50 ml（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）+ 0.5 % 淀粉，裝入 250 ml 三角瓶?jī)?nèi)。 2）滅菌：121 高壓蒸氣滅菌 15 min。 3）接種：培養(yǎng)基冷卻后，將枯草芽孢桿菌斜面菌接入

45、液體培養(yǎng)基（注意無(wú)菌操作），室溫 37，旋轉(zhuǎn) 式搖床 120 r / min 培養(yǎng) 1 周。 2. 2. 酶活力檢測(cè)酶活力檢測(cè) 1）取發(fā)酵液 5 ml，裝入離心管中，在 5000 r / min 下離心 5 min，上清液即為粗酶液。 2）配制50 ml 2 % 可溶性淀粉液，用100 ml 的燒杯稱取 1 g 可溶性淀粉，加入50 ml 蒸餾水，然后在 電爐上加熱至液體清澈透明為止。 3） 向干凈的試管中加入 2 % 可溶性淀粉液 10 m l 及 （pH 6.0） 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液 1 ml， 在 70 水浴中平衡約 5 min 左右，然后加入 1 ml 上清液（酶液） ，充分混勻

46、并立即計(jì)時(shí)，繼續(xù)在水浴鍋中保溫。 5）每隔 30 s 取 1 滴反應(yīng)液滴入預(yù)先盛有比色稀碘液（4 滴）的白瓷板空穴內(nèi)，當(dāng)顏色反應(yīng)由紫色逐 漸變?yōu)樽爻壬?，即為反?yīng)終點(diǎn)，記錄時(shí)間。 D 60 6）計(jì)算 -淀粉酶活力( )： （三）實(shí)驗(yàn)報(bào)告（三）實(shí)驗(yàn)報(bào)告 12 / 14 60 酶活力/u ml1（102%n） 1 t 60 式中：t 為反應(yīng)時(shí)間（min） ；n 為酶液稀釋倍數(shù)；1 是使用的酶液量（ml） 。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和計(jì)算公式，計(jì)算出枯草芽孢桿菌產(chǎn)-淀粉酶的酶活力，寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告。 實(shí)驗(yàn)七實(shí)驗(yàn)七管碟法測(cè)抗生素效價(jià)管碟法測(cè)抗生素效價(jià) （一）基本原理（一）基本原理 管碟法就是利用有一定體積的不銹鋼制的小

47、管，叫牛津杯，將抗生素溶液裝滿小杯，并在含有敏感實(shí) 驗(yàn)菌的瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)散滲透作用，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，抗生素?cái)U(kuò)散到適當(dāng)?shù)姆秶?，產(chǎn)生透明的抑菌圈。 抑菌圈的半徑與抗生素在管中的總量(單位)、抗生素的擴(kuò)散系數(shù)（cm2/h） 、擴(kuò)散時(shí)間（即抗生素溶液注入鋼 管至出現(xiàn)抑菌圈所需的時(shí)間） 、培養(yǎng)基的厚度（mm）和最低抑菌濃度（U/ml）等因素有關(guān)?？股乜偭康?對(duì)數(shù)和抑菌圈直徑的平方呈直線關(guān)系。因此，抗生素效價(jià)可以由抑菌圈的大小來(lái)衡量。 （二）實(shí)驗(yàn)材料（二）實(shí)驗(yàn)材料 1. 1. 菌種：菌種：金黃色葡萄球菌 2. 2. 培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基 3. 3. 試劑：試劑：含 10 000 單

48、位鏈霉素母液 （三）實(shí)驗(yàn)步驟（三）實(shí)驗(yàn)步驟 1. 1. 配制培養(yǎng)基：配制培養(yǎng)基：每組配制牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基100 ml，裝于 250 ml 錐形瓶?jī)?nèi)。 2. 2. 洗滌、包扎物品：洗滌、包扎物品：每組包扎大平皿 1 套。 3. 3. 配制鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品：配制鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品：不同濃度鏈霉素溶液。 4. 4. 制備混菌平板：制備混菌平板：將冷卻至 50 左右的培養(yǎng)基，加入金色葡萄球桿菌菌懸液2 ml，輕輕搖勻，傾入 大培養(yǎng)皿中，凝固后即成混菌平板，備用。 5. 5. 放置牛津杯：放置牛津杯：在底皿上分別標(biāo)上 100、200、500、1000、1500 和待測(cè)液，將已滅菌的牛津杯放置在 與所標(biāo)數(shù)字或標(biāo)記對(duì)應(yīng)的平板表面（共6 個(gè)牛津杯） 。 6. 6. 滴加鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品和樣品：滴加鏈霉素