1、IR-SEQ,1,目錄,免疫組庫（IR） 免疫組庫測序技術(shù) 信息分析,2,1、免疫組庫概念,免疫組庫（Immune Repertoire，IR）是指在任何指定時間，某個個體的循環(huán)系統(tǒng)中所有功能多樣性B細(xì)胞和T細(xì)胞的總和。研究免疫組庫就要測定免疫系統(tǒng)中的BCR和TCR的基因或RNA分子序列。 影響免疫組庫組成的因素有很多種。比如年齡、疾病、免疫記憶、免疫缺陷遺傳疾病、疫苗、器官移植、癌癥治療等。,3,根據(jù)淋巴細(xì)胞DNA來源的不同，對于免疫組庫的研究分為以下幾大類：健康人士一般采用抽取外周血的方式；特殊人群比如白血病人或者白血病細(xì)胞微小殘留?。∕RD）患者，為了深入研究其免疫組庫的變化也將骨髓血作

2、為淋巴細(xì)胞DNA的來源；剛出生的嬰兒，其臍帶血可以用于研究人在出生早期與母親在免疫組庫方面的聯(lián)系與區(qū)別；而對于動物來說尤其是小型動物，脾臟也是常見淋巴細(xì)胞的DNA來源臟器。 以唾液和尿液作為淋巴細(xì)胞DNA來源的方式。 ,4,2、BCR,B細(xì)胞受體（BCR）又稱為免疫球蛋白（IG），它是由B細(xì)胞分泌的可以和抗原結(jié)合的蛋白質(zhì)分子。成熟的B細(xì)胞可以將IG分泌到細(xì)胞外面以中和抗原。免疫球蛋白由兩條重鏈（heavy chain, H），兩條輕鏈（light chain, L）中間通過二硫鍵連接而成。重鏈（IGH）由 Variable（V），Diversity（D），Joining（J）和Constant

3、（C）基因片段重組而來；輕鏈（IGL）只由V-J-C重組而來。重鏈（H鏈）又分為V區(qū)、C區(qū)、跨膜區(qū)及胞質(zhì)區(qū)；而輕鏈（L鏈）則只有V區(qū)和C區(qū)。V區(qū)由VH和VL兩個結(jié)構(gòu)域組成，各有3個CDR即CDR1、CDR2和CDR3。,5,決定B淋巴細(xì)胞識別抗原的關(guān)鍵部位是最具多樣性的重鏈CDR3區(qū)，其多樣性的產(chǎn)生源于IGHV（51個功能性基因片段）末端-IGHD(23個功能性基因片段）-IGHJ前端（6個功能性基因片段）基因重排及V-D和D-J連接時非模板依賴性核苷酸插入或剪切和體細(xì)胞高頻突變等。,6,3、TCR,T細(xì)胞受（TCR）是由T細(xì)胞分泌的膜蛋白分子，與BCR不同的是TCR只在細(xì)胞表面而不分泌出去。

4、一個T細(xì)胞的TCR可以是鏈和鏈組成的，或者由鏈和鏈組成的。鏈和鏈由V-J-C基因片段重組而來，鏈和鏈由V-D-J-C基因片段重組而來，這也類似于BCR的重鏈和輕鏈。參與特異性免疫應(yīng)答的T淋巴細(xì)胞主要是/ T淋巴細(xì)胞，占外周淋巴細(xì)胞的90-95%。TCR 鏈CDR3在抗原特異性識別中起關(guān)鍵作用，是直接與抗原肽的結(jié)合位點，其編碼基因位于人類7號染色體（7q34），全長620kb，由50多個可變區(qū)（V區(qū)）基因片段、2組上游D基因片段/下游恒定區(qū)（C區(qū)） 基因片段、67個J區(qū)基因片段組成，這些基因在T淋巴細(xì)胞發(fā)育早期不連續(xù)分布，在胸腺內(nèi)原始T細(xì)胞階段，D-J區(qū)片段連接為 DJ片段；在成熟T淋巴細(xì)胞階段

5、，V、D、J、C區(qū)基因片段相連成 VDJC片段。,7,據(jù)推測，胚系VDJC基因片段隨機組合、重排以及TCR /鏈和/ 鏈V區(qū)基因重排產(chǎn)生的TCR克隆數(shù)量高達1015-1018，構(gòu)成多樣性極其豐富的T淋巴細(xì)胞抗原受體庫。不同T淋巴細(xì)胞克隆有不同序列或長度的TCR-CDR3基因，翻譯出不同的CDR3多肽序列，從而反映T淋巴細(xì)胞功能狀態(tài)。在發(fā)生特異性免疫應(yīng)答時，TCR多樣性發(fā)生變化，出現(xiàn)寡克隆甚至單克隆擴增，隨著胸腺再生，大量原始T淋巴細(xì)胞增殖，TCR免疫組庫多樣性得以恢復(fù)和重建。,8,不同VDJ基因片段組合的多樣化； 不同基因片段連接時隨機插入刪除造成連接的多樣化，V(D)J連接區(qū)核苷酸的插入和刪

6、除，體現(xiàn)為互補決定區(qū)簇CDR3)序列多樣性； 不同重鏈和輕鏈組合的多樣化； 以及 B 細(xì)胞受體特有的隨機高頻突變。,4、BCR/TCR多樣性產(chǎn)生機制,9,5、研究免疫組庫的流程,提取樣本DNA/RNA:根據(jù)所要研究的問題設(shè)計試驗方案，提取血液或組織樣本，分離B細(xì)胞或T細(xì)胞，然后提取和純化DNA/RNA。 構(gòu)建測序文庫:根據(jù)不同實驗情況加入不同擴增引物進行PCR擴增，從而擴增出想要測序的免疫基因，最后構(gòu)建測序文庫。 測序:利用二代高通量測序儀，如Roche 454、Illumina Hi Seq2500、Illumina Mi Seq等進行測序。 信息分析:對測出來的序列數(shù)據(jù)進行信息挖掘，來發(fā)掘

7、出生物學(xué)意義與結(jié)果。數(shù)據(jù)分析主要包括數(shù)據(jù)清理、質(zhì)量控制、不同樣本數(shù)據(jù)分離、序列比對、序列注釋以及下游的各種分析。,10,11,二、免疫組庫測序,12,1、免疫組庫測序概念,免疫組庫測序（Immune Repertoire sequencing(IR-SEQ)）是以 T/B 淋巴細(xì)胞為研究目標(biāo)，用多重PCR技術(shù)或5RACE擴增決定B細(xì)胞受體（BCR）或T細(xì)胞受體（TCR）多樣性的互補決定區(qū)（CDR3區(qū)），再結(jié)合高通量測序技術(shù)（HTS），全面評估免疫系統(tǒng)的多樣性，深入挖掘免疫組庫與疾病的關(guān)系。,13,2、兩種PCR技術(shù)的優(yōu)缺點,14,Arm-PCR是最新開創(chuàng)的一種高效擴增子救援多重PCR，它克服了

8、傳統(tǒng)多重PCR的缺限。通過在擴增的早期使用基因靶點特異性的引物，而在指數(shù)擴增期使用共用的引物，使得所有模板的擴增效率大大提高，因而具有較高的特異性和靈敏性。,15,3、模板比較,基因組雖然DNA容易制備，但PCR擴增過程中易產(chǎn)生非產(chǎn)出性的重組序列，且J-C區(qū)之間存在的大量內(nèi)含子使其下游引物只能位于J區(qū)，PCR擴增的敏感性一般由細(xì)胞的拷貝量決定；相對而言，RNA需取自新鮮的標(biāo)本，其產(chǎn)物多為產(chǎn)出性的CDR3序列，下游引物可選自C區(qū)，具有高度的敏感性。,16,4、主流測序技術(shù)及優(yōu)缺點,17,免疫組庫分析的精確性依賴于HTS數(shù)據(jù)的可靠性。而HTS數(shù)據(jù)的可靠性又依賴于測序的準(zhǔn)確性和覆蓋的深度。,18,T

9、hermo測序平臺,Ion Torrent:革新性的半導(dǎo)體芯片測序技術(shù)平臺 原理是：向 DNA 聚合物中加入 dNTP，會釋放出氫離子。我們采用半導(dǎo)體測定這些氫離子引起的 pH 變化，通過同時測量數(shù)百萬起此類變化，可以測定各個片段的序列。 高效靶向覆蓋-運用多重PCR設(shè)計實現(xiàn)平均97%靶向覆蓋 讀長-可選擇200bp或400bp讀長,19,5、信息分析,1、基本數(shù)據(jù)統(tǒng)計 數(shù)據(jù)過濾，對原始數(shù)據(jù)進行去除接頭污染序列及低質(zhì)量reads的處理 數(shù)據(jù)搭建，數(shù)據(jù)拼接，消除測序背景及有效數(shù)據(jù)構(gòu)建 數(shù)據(jù)統(tǒng)計，數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計及測序數(shù)據(jù)的成分和質(zhì)量評估 2、數(shù)據(jù)比對分析 比對分析，與數(shù)據(jù)庫（IMGT）V/D/J基因

10、片段比對 重新比對，尋找最佳V/D/J比對結(jié)果 3、序列結(jié)構(gòu)分析 分析CDR序列組成及序列堿基成分 分析CDR序列的堿基插入和缺失 編碼CDR序列翻譯成氨基酸和肽鏈,20,4、免疫組庫構(gòu)建 構(gòu)建免疫組庫表達譜，統(tǒng)計多樣性抗體庫克隆表達情況 免疫組庫多樣性呈現(xiàn)，繪制V/J基因表達的2D、3D圖 5、免疫組庫差異分析 樣品間多樣性差異分析（辛普森系數(shù)、香農(nóng)威納系數(shù)） 樣品間克隆表達差異分析（CDR3，V-D-J） 分組樣品間的克隆表達差異分析（CDR3，V-D-J）,21,6、IR-SEQ存在的問題,1、構(gòu)建免疫組庫的過程實際上是基于多重引物PCR來覆蓋BCR或TCR序列多樣性的過程，這就會涉及多重引物之間擴增效率導(dǎo)致的偏好性的問題，一套好的多重引物總會平衡各對引物之間的擴增效率以及盡量避免引物間的非特異性擴增和二（多）聚體，可以說構(gòu)建的免疫組庫質(zhì)量的好壞直接取決于其多重引物質(zhì)量的高低。,22,2、以人體內(nèi)BCR為例，保守估計BCR的種類多樣性在1011這一數(shù)量級級別上，其中骨髓方面占17%，全身淋巴結(jié)占到28%，脾臟和粘膜系統(tǒng)占23%，外周血方面僅占2%，其他約占30%。然而我們對人免疫組庫的研究往往是以來源方便的外周血，顯然外周血對免疫組庫多樣性的貢獻率2%遠遠不足，為了能盡量完全地反映人群的免疫組庫全貌，我們可以通過增加樣本量的方式來彌