1、實驗一生物信息數(shù)據(jù)庫及生物信息分析軟件應(yīng)用,現(xiàn)代分子生物學(xué)大實驗,實驗?zāi)康?掌握生物信息學(xué)基本概念、原理及方法 應(yīng)用生物信息學(xué)的一些工具進行初步的生物信息分析 運用Primer Primier 5進行引物設(shè)計,實驗主要內(nèi)容,分子生物學(xué)數(shù)據(jù)庫：掌握數(shù)據(jù)庫的種類、功能，文獻查找方法 相似序列的數(shù)據(jù)庫搜索：掌握NCBI中幾種基本局部序列比對方法及幾種單機軟件的使用方法（Blastn；Blastp；Blastx；tBlastn）。 生物信息學(xué)單機軟件介紹：Primer Primier 5,歐洲分子生物學(xué)實驗室 EMBL( European Molecular Biology Laboratory )

2、美國生物技術(shù)信息中心 NCBI (National Center for Biotechnology Information ) 日本遺傳研究所 DDBJ (DNA Data Bank of Japan ),國際權(quán)威數(shù)據(jù)庫,國際權(quán)威數(shù)據(jù)庫,蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫 SWISS-PROT TrEMBL (translation of EMBL) PIR (Promoter information resource) PRF （Promoter research foundation） PDBSTR （Re-organized Protein data Bank）Prosite 結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫 PDB (Prot

3、ein Data Bank) NDB (Nucleic Acid Database) DNA-bind Protein databaseswiss-3D IMAGE 酶和代謝數(shù)據(jù)庫KEGG （Kyoto Eneyclopedin of genes & genemes） PKR (Protein Kinase Resource) 文獻數(shù)據(jù)庫PubMed OMIM Agricola,常用數(shù)據(jù)庫,孟德爾人類遺傳（OMIM），三維蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子模型數(shù)據(jù)庫（MMDB），唯一人類基因序列集合（UniGene），人類基因組基因圖譜，分類學(xué)瀏覽器，同國立癌癥研究所合作的癌癥基因組剖析計劃（CGAP）。 En

4、trez是NCBI的為用戶提供整合的訪問序列，定位，分類和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的搜索和檢索系統(tǒng)。Entrez同時也提供序列和染色體圖譜的圖形視圖。Entrez是一個用以整合NCBI數(shù)據(jù)庫中信息的搜尋和檢索工具。這些數(shù)據(jù)庫包括核酸序列，蛋白序列，大分子結(jié)構(gòu)，全基因組，和通過PubMed檢索的MEDLINE。Entrez的一個強大和獨特的特點是檢索相關(guān)的序列，結(jié)構(gòu)和參考文獻的能力。雜志文獻通過PubMed獲得，PubMed是一個網(wǎng)絡(luò)搜索界面，可以提供對在MEDLINE上的九百萬雜志引用的訪問，包含了鏈接到參與的出版商網(wǎng)絡(luò)站點的全文文章。 BLAST是一個NCBI開發(fā)的序列相似搜索程序，還可作為鑒別基因和遺傳特

5、點的手段。BLAST能夠在小于15秒的時間內(nèi)對整個DNA數(shù)據(jù)庫執(zhí)行序列搜索。NCBI提供的附加的軟件工具有：開放閱讀框?qū)ひ捚鳎∣RF Finder），電子PCR，和序列提交工具，Sequin和BankIt。所有的NCBI數(shù)據(jù)庫和軟件工具可以從WWW或FTP來獲得。NCBI還有E-mail服務(wù)器，提供用文本搜索或序列相似搜索訪問數(shù)據(jù)庫一種可選方法。,NCBI相關(guān)介紹,核苷酸數(shù)據(jù)庫,dbEST EST來源于mRNA基因長度（300-400bp，數(shù)據(jù)長度足以分析編碼的產(chǎn)物）或者全基因（已知）5端或3端的cDNA序列（EST）300-400bp single-pass sequence （可能有誤，如

6、果要求2kb） dbSNP 每100-300bp有一個SNP EPD （Eukaryotic Promoter Database） 啟動子數(shù)據(jù)庫,文獻數(shù)據(jù)庫,序列相關(guān)檢索操作,序列查詢 登錄號（如X58929） 序列名稱（如SCARGC） 核酸同源性搜索 BLAST分析 瀏覽整個基因組 直觀顯示各染色體，可以在染色體水平上選擇感興趣的位點，逐層放大,瀏覽染色體,瀏覽染色體,瀏覽染色體,Blastp：氨基酸序列檢索蛋白質(zhì)庫 將待查詢的蛋白質(zhì)序列及其互補序列一起對蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進行查詢；(Search a nucleotide database using a nucleotide query)

7、 Blastn：核苷酸序列檢索核苷酸庫 將待查詢的核酸序列及其互補序列一起對核酸序列數(shù)據(jù)庫進行查詢；(Search a nucleotide database using a nucleotide query) Blastx：核苷酸序列氨基酸序列蛋白質(zhì)庫 先將待查詢的核酸序列按6種可讀框架(逐個向前3個堿基和逐個向后3個堿基讀碼)翻譯成蛋白質(zhì)序列，然后將翻譯結(jié)果對蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進行查詢；(Search protein database using a translated nucleotide query ) tBlastn 先將核酸序列數(shù)據(jù)庫中的核酸序列按6種可讀框架翻譯成蛋白質(zhì)序列，然后

8、將待查詢的蛋白質(zhì)序列及其互補序列對其翻譯結(jié)果進行查詢；(Search translated nucleotide database using a protein query ) tBlastx 先將待查詢的核酸序列和核酸序列數(shù)據(jù)庫中的核酸序列按6種可讀框架翻譯成蛋白質(zhì)序列，然后再將2種翻譯結(jié)果從蛋白質(zhì)水平進行查詢。(Search translated nucleotide database using a translated nucleotide query ),同源性搜索（Basic Local Alignment Search Tool ）,序列特征注釋Annotation by se

9、quence features,Subcellular Localization,None Signal peptide,None obvious transmembrane region,Motifs,Domains,Pfam,InterPro,Coiled Coil Regions,STRUCTURE,Can not find data in PDB,Predicted in GTD,多序列比對Multiple sequence alignment analysis,ClustalW, view as JalView,引物設(shè)計 primer primer 5 軟件,引物設(shè)計的一般步驟 序列

10、查詢 單基因序列 多基因序列 引物設(shè)計 引物確定,引物的設(shè)計原則,引物與模板的序列要緊密互補 引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu) 引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯配),引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74，不適于Taq DNA聚合酶進行反應(yīng)。 引物所對應(yīng)模板位置序列的Tm值在72左右可使復(fù)性條件最佳。Tm值的計算有多種方法，如按公式Tm4(G+C)2(A+T)，在Oligo軟件中使用的是最鄰近法(the nearest neighbor method)。 Tm值：50的引物和互補序列表現(xiàn)為雙鏈D

11、NA分子時的溫度,引物的設(shè)計原則,引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯配。引物3端出現(xiàn)3個以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發(fā)機率增加。 引物3端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導(dǎo)致不同的擴增效率，末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3端使用堿基A。,引物的設(shè)計原則,引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進行。 5端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標(biāo)記物。對引物的修飾一般是在5端增加酶切位點，應(yīng)根據(jù)下一步實驗中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。,引物的設(shè)計原則,primer primer 5 軟件的使用,primer primer 5 軟件的使用,primer primer 5 軟件的使用,primer primer 5 軟件的使用,primer primer 5 軟件的