1、微生物的計(jì)數(shù)技術(shù),1,一、測(cè)定微生物數(shù)量的方法,直接計(jì)數(shù)法（總菌計(jì)數(shù)法） 顯微鏡直接計(jì)數(shù)法 間接計(jì)數(shù)法 稀釋平板計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法） 液體稀釋培養(yǎng)法 比濁法 濃縮法,2,顯微鏡直接計(jì)數(shù)法,是將小量待測(cè)樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上，于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種簡(jiǎn)便、快速、直觀的方法。 細(xì)菌計(jì)數(shù)板（一般）-薄 血球計(jì)數(shù)板（菌體較大）酵母菌霉菌孢子 -厚 （二者原理和部件相同，只是厚薄不同而已）,3,直接計(jì)數(shù)法（總菌數(shù)測(cè)定法）,顯微鏡直接計(jì)數(shù)法操作（視頻） 1、優(yōu)點(diǎn)：所需設(shè)備簡(jiǎn)單，可迅速得到結(jié)果，能同時(shí)觀察微生物形態(tài)特征； 2、缺點(diǎn)：難以計(jì)數(shù)微小的細(xì)菌；難與區(qū)分死、活 3、適用

2、于純培養(yǎng)懸浮液中各種單細(xì)胞菌體的計(jì)數(shù),4,血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的厚載玻片，載玻片上有4條槽而構(gòu)成3個(gè)平臺(tái)。中間的平臺(tái)較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個(gè)半邊上面各有一個(gè)方格網(wǎng)。每個(gè)方格網(wǎng)共分9大格，其中間的一大格(又稱(chēng)為計(jì)數(shù)室)常被用作微生物的計(jì)數(shù)。,血球計(jì)數(shù)板,5,計(jì)數(shù)室的刻度有兩種：一種是大方格分為16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格；另一種是一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格。但是不管計(jì)數(shù)室是哪一種構(gòu)造，它們都有一個(gè)共同特點(diǎn)，即每個(gè)大方格都由400個(gè)小方格組成。,6,血球計(jì)數(shù)板,A.正面圖 B.縱切面圖 1.血球計(jì)數(shù)板 2.蓋玻片 3.計(jì)數(shù)室,7,8,

3、16小格 25中格計(jì)數(shù)室,25小格 16中格計(jì)數(shù)室,圖5-2 計(jì)數(shù)室的兩種刻度形式,9,每個(gè)大方格邊長(zhǎng)為1mm，則每一大方格的面積為1mm2，每個(gè)小方格的面積為1400mm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與計(jì)數(shù)室底部之間的高度為0.1mm，所以每個(gè)計(jì)數(shù)室(大方格)的體積為0.1mm3，每個(gè)小方格的體積為l4000mm3。 使用血球計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)時(shí)，先要測(cè)定每個(gè)小方格(或中方格)中微生物的數(shù)量，再換算成每毫升菌液(或每克樣品)中微生物細(xì)胞的數(shù)量。,10,已知：1毫升=1cm3=1000mm3 cm3體積應(yīng)含有小方格數(shù)為1000mm3（ l4000mm3） X106,11,計(jì)數(shù),左上、左下、右上、右下 左

4、上、左下、右上、右下、中格（100小格） （80小格）,16中格 25小格計(jì)數(shù)室,25中格 16小格計(jì)數(shù)室,12,13,l.菌懸液制備 以無(wú)菌生理鹽水制成濃度適當(dāng)?shù)木鷳乙?。每小格?nèi)約有35個(gè)菌體為宜。 2.鏡檢計(jì)數(shù)室在加樣前，先對(duì)計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)。 3.加樣品將清潔干燥的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無(wú)菌的毛細(xì)滴管將搖勻菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自動(dòng)進(jìn)入計(jì)數(shù)室，一般計(jì)數(shù)室均能充滿菌液。取樣時(shí)先要搖勻菌液；加樣時(shí)計(jì)數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生。,操作步驟,14,4.顯微鏡計(jì)數(shù)加樣后靜止5min，然后將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上，先

5、用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。在計(jì)數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計(jì)數(shù)。位于中格雙線上的菌體一般只數(shù)上方和左邊線上的。如遇芽胞大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時(shí)，即作為兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從兩個(gè)計(jì)數(shù)室中計(jì)得的平均數(shù)值來(lái)計(jì)算樣品的含菌量。 5.清洗血細(xì)胞計(jì)數(shù)板使用完畢后，將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在水龍頭用水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。鏡檢，觀察每小格內(nèi)是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。,15,1.有壓線的菌體，計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右。出芽計(jì)一半。 2.因菌液在血球計(jì)數(shù)板處于不同空間，要在不同焦距下才能看全，所以，觀察

6、時(shí)必須不斷調(diào)細(xì)螺旋（調(diào)焦距長(zhǎng)短），方可找全 3.每個(gè)樣品重復(fù)23次，若兩次差別太大應(yīng)重測(cè),五、注意事項(xiàng),16,死、活細(xì)菌的區(qū)分,17,間接計(jì)數(shù)法,稀釋平板計(jì)數(shù)法 一般將被檢樣品制成幾個(gè)不同的10倍遞增稀釋液，然后從每個(gè)稀釋液中分別取出1mL置于滅菌平皿中與營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混合，在一定溫度下，培養(yǎng)一定時(shí)間后（一般為48小時(shí)），記錄每個(gè)平皿中形成的菌落數(shù)量，依據(jù)稀釋倍數(shù)，進(jìn)行菌落總數(shù)的測(cè)定， 每ml(g)樣品中的活菌數(shù)=（每皿菌落數(shù)平均值/取樣體積）稀釋倍數(shù),18,特點(diǎn),1、由于死亡的細(xì)菌不能繁殖成菌落，所以該法只計(jì)數(shù)活菌數(shù)； 2、該法統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低，原因是當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一

7、起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落； 3、為使結(jié)果接近真實(shí)值，可將同一稀釋度菌液加到三個(gè)或三個(gè)以上的平板上，計(jì)算菌落平均數(shù)。 4、細(xì)菌、放線菌、酵母菌以每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)有30-300個(gè)菌落為宜；霉菌以每個(gè)培養(yǎng)皿10-100個(gè)為宜。,19,平板菌落計(jì)數(shù)法雖然操作較繁，結(jié)果需要培養(yǎng)一段時(shí)間才能取得，而且測(cè)定結(jié)果易受多種因素的影響，但是，由于該計(jì)數(shù)方法的最大優(yōu)點(diǎn)是可以獲得活菌的信息，所以被廣泛用于生物制品檢驗(yàn)(如活菌制劑)，以及食品、飲料和水(包括水源水)等的含菌指數(shù)或污染程度的檢測(cè),20,用稀釋平板計(jì)數(shù)時(shí)，待測(cè)菌稀釋度的選擇應(yīng)根據(jù)樣品確定。樣品中所含待測(cè)菌的數(shù)量多時(shí)，稀釋度應(yīng)高，反之則低。,21,通常測(cè)

8、定細(xì)菌菌劑含菌數(shù)時(shí)，10-7、10-8、10-9 土壤細(xì)菌數(shù)量，采用10-4、10-5、10-6 放線菌數(shù)量，采用l0-3、10-4、10-5 真菌數(shù)量，采用10-2、10-3、10-4,22,混合平板培養(yǎng)法涂抹平板培養(yǎng)法。,2平板接種培養(yǎng),23,將無(wú)菌平板編上10-7、10-8、10-9號(hào)碼，每一號(hào)碼設(shè)置三個(gè)重復(fù)，用無(wú)菌吸管按無(wú)菌操作要求吸取10-9稀釋液各1ml放入編號(hào)10-9的3個(gè)平板中，同法吸取10-8稀釋液各lml放入編號(hào)10-8的3個(gè)平板中，再吸取10-7稀釋液各lml放入編號(hào)10-7的3個(gè)平板中（由低濃度向高濃度時(shí)，吸管可不必更換）。然后在9個(gè)平板中分別倒入已融化并冷卻至4550

9、的細(xì)菌培養(yǎng)基，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)平板(P112)，使菌液與培養(yǎng)基混合均勻，冷疑后倒置，適溫培養(yǎng)。至長(zhǎng)出菌落后即可計(jì)數(shù)。,（1）混合平板培養(yǎng)法,24,（2）涂抹平板計(jì)數(shù)法,涂抹平板計(jì)數(shù)法與混合法基本相同，所不同的是先將培養(yǎng)基熔化后趁熱倒入無(wú)菌平板中，待凝固后編號(hào)，然后用無(wú)菌吸管吸取0.1ml菌液對(duì)號(hào)接種在不同稀釋度編號(hào)的瓊脂平板上（每個(gè)編號(hào)設(shè)三個(gè)重復(fù)）。再用無(wú)菌刮鏟將菌液在平板上涂抹均勻，每個(gè)稀釋度用一個(gè)滅菌刮鏟，更換稀釋度時(shí)需將刮鏟灼燒滅菌。在由低濃度向高濃度涂抹時(shí)，也可以不更換刮鏟。將涂抹好的平板平放于桌上2030min，使菌液滲透入培養(yǎng)基內(nèi)，然后將平板倒轉(zhuǎn)，保溫培養(yǎng)，至長(zhǎng)出菌落后即可計(jì)數(shù)。,25,基

10、本操作一般包括：樣品的稀釋傾注平皿培養(yǎng)48小時(shí)計(jì)數(shù)報(bào)告。,26,結(jié)果計(jì)算,計(jì)算結(jié)果時(shí)，常按下列標(biāo)準(zhǔn)從接種后的3個(gè)稀釋度中選擇一個(gè)合適的稀釋度，求出每克菌劑中的含菌數(shù)。 (1）同一稀釋度各個(gè)重復(fù)的菌數(shù)相差不太懸殊。 （2）細(xì)菌、放線菌、酵母菌以每皿30300個(gè)菌落為宜，霉菌以每皿10100個(gè)菌落為宜。 選擇好計(jì)數(shù)的稀釋度后，即可統(tǒng)計(jì)在平板上長(zhǎng)出的菌落數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果按下式計(jì)算。,27,每ml(g)樣品中的活菌數(shù)= （每皿菌落數(shù)平均值/取樣體積）稀釋倍數(shù),混合平板計(jì)數(shù)法： 每ml(g)樣品的菌數(shù)=同一稀釋度幾次重復(fù)的菌落平均數(shù)稀釋倍數(shù) 涂抹平板計(jì)效法： 每ml(g)樣品的菌數(shù)=同一稀釋度幾次重復(fù)的菌落平均數(shù)10稀釋倍數(shù),28,將實(shí)驗(yàn)結(jié)果填入下表中,29,菌落計(jì)數(shù)規(guī)則：,（一）選擇平均菌落數(shù)在30300間的平板 1、只有一個(gè)稀釋度符合，以該稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告； 2、有兩個(gè)稀釋度符合，取決于二者比值（高稀釋度的菌落數(shù)除以低稀釋度的菌落數(shù)的值）： 若比值小，報(bào)告平均數(shù)；若比值大于2，報(bào)告其中較