1、課題2 土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù),一、課題背景,1、尿素的利用,尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、細菌利用尿素的原因,土壤中的細菌分解尿素是因為它們能合成脲酶,培養(yǎng)基配方三 KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO47H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 瓊脂 15.0g,培養(yǎng)基配方二 KH2PO4 3g MgSO47H2O 3g 蛋白胨 2g 葡萄糖 10.0g 尿素 3.0g 瓊脂 15.0g,培養(yǎng)基配方一 KH2PO4 3g Na2HPO4 1.4g NaNO3 2g MgSO

2、47H2O 3g 葡萄糖 10.0g 瓊脂 15.0g,二、研究思路,（一）篩選菌株,（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目,（三）設置對照,1、實例：,啟示：尋找目的菌種時要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應的環(huán)境中去尋找。,原因：因為熱泉溫度70800C，淘汰了絕大多數(shù)微生物只有Taq細菌被篩選出來。,DNA多聚酶鏈式反應是一種在體外將少量DNA大量復制的技術，此項技術要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。,.篩選菌株,2、實驗室中微生物的篩選原理：,原理：人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。,方法：選擇培養(yǎng)基：在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同

3、時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。,一、篩選菌株,無機鹽,碳源,氮源,凝固劑,從物理性質看此培養(yǎng)基屬于哪類？從功能上屬于哪類培養(yǎng)基？,固體培養(yǎng)基,選擇培養(yǎng)基,在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素,此配方能否篩選出產(chǎn)生脲酶的細菌？為什么？,能。只有產(chǎn)生脲酶的細菌能利用尿素作為氮源而生存,1、顯微鏡直接計數(shù)：,利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。,統(tǒng)計菌落數(shù)目,不能區(qū)分死菌與活菌； 不適于對運動細菌的計數(shù)； 需要相對高的細菌濃度； 個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察；,（2）缺點：,（1）原理：,（3）操作方法： 稀釋菌液-涂布平板統(tǒng)計菌落數(shù)

4、（4）統(tǒng)計原則: 選 30300 個菌落的平板統(tǒng)計 每個稀釋度取3個平板取其平均值,2、間接計數(shù)法（活菌計數(shù)法）,稀釋涂布平板法。,1個菌落1個活菌,（1）常用方法：,（2）原理：,每克樣品中的菌落數(shù)(CV)M 其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。,例：兩位同學用稀釋涂布平板法測定同 一土壤樣品中的細菌數(shù)。從對應稀釋倍數(shù)為 106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計結果。 1、甲同學在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)為230。 2、乙同學在該濃度下涂布了A、B、C三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別為21、212、256，該同學以這三個

5、平板上菌落數(shù)的平均值163作為統(tǒng)計結果。 你認為這兩位同學的作法正確嗎？如果有問題，錯在哪？,甲：沒有重復實驗（至少涂布3個平板） 乙：A組結果誤差過大，不應用于計算平均值,?,注意事項 為了保證結果準確，一般選擇菌落數(shù)在30300的平板上進行計數(shù)。 為使結果接近真實值可將同一稀釋度加到三個或三個以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計算出菌落平均數(shù)。 統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。 涂布平板法所選擇的稀釋度很重要，一般以三個稀釋度中的第二個稀釋度所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個左右為最好。,三、設置對照,排除無關變量（非測試因素）的影響，提高實驗結果的可信度。,分析實例：書P2223,原因：土樣不同，培養(yǎng)

6、基污染或操作失誤(或者是混入了其他的含氮物質),目的：,小結：通過這個事例可以看出，實驗結果要有說服力，對照的設置是必不可少的。,方案一：由其他同學用與A同學相同土樣進行實驗,方案二：將A同學配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。,結果預測：如果結果與A同學一致，則證明A無誤；如果結果不同，則證明A同學存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。,1、設置對照的目的： 排除實驗組中非測試因素對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度。 對照實驗是指除了 被測試 的條件外，其他條件都 相同 的實驗。滿足該條件的稱為 對照組，未滿足該條件的稱為 實驗 組,2.設置對照的

7、方法：,空白對照：不給對照組任何處理因素。,條件對照：給對照組施以部分實驗因素，但不是所要研究的處理因素。,自身對照：對照組和實驗組都在同一研究對象上進行。,相互對照：不單設對照組，而是幾個實驗組相互對照。,四、實驗設計,土壤取樣制備培養(yǎng)基樣品稀釋涂布培養(yǎng)觀察統(tǒng)計,1.取樣時，一般要鏟去表層土。 2.分別制備 的選擇性培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（判斷選擇培養(yǎng)基是篩選出分解尿素的細菌） 3.不同的微生物要采用不同的稀釋度。（保證菌落數(shù)在30300之間） 4.每個稀釋度需4個選擇性培養(yǎng)基，3個涂布，1個空白； 5.不同種類的微生物往往需要不同的培養(yǎng)溫度和時間。（選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結果）,

8、以尿素為唯一氮源,為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？ 答：這是因為土壤中各類微生物的數(shù)量（單位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細菌數(shù)約為2 185萬，放線菌數(shù)約為477萬，霉菌數(shù)約為23.1萬。因此，為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進行分離，同時還應當有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。,旁欄思考,怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？,以尿素為 唯一氮源 的培養(yǎng)基,牛肉膏 蛋白胨 培養(yǎng)基,是,分離 尿素 細菌,判斷該 培養(yǎng)基 有無選 擇性,實驗組,對照組,只生長尿素細菌,生長多種微生物,是,思考,將待測樣品經(jīng)一系列10倍稀釋，然后選擇三個稀釋度的菌液，分別取0.1 mL接種到已制備好的平板上，將同一稀釋度加到三個或三個以上的平板上；培養(yǎng)后，計算出同一稀釋度菌落平均數(shù)。,三重復組 求平均值使結果更準確,五、實驗結果的分析、評價,(1)空白對照：是否有雜菌污染 (2)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基對照： 選擇培養(yǎng)基是否有選擇作