1、1,第五章. 基因工程載體,2,載體類型基因工程所用的載體都經過人工重新構建,細菌質粒載體 噬菌體衍生載體 Cosmid載體（粘粒） 噬菌體M13衍生載體 Phagemid載體 酵母質粒載體 真核病毒載體,3,克隆載體與表達載體 克隆載體：攜帶外源DNA進入受體細胞并 使外源DNA大量擴增。 表達載體：表達外源基因編碼的蛋白質，載體克隆位點的上游應含有啟動子，下游含有轉錄終止序列。,4,第一 節(jié). 質粒,Plasmid 質粒是存在于細菌細胞染色體外、 能自主復制的小分子環(huán)狀雙鏈DNA分子。 又稱為cccDNA（Covalently Closed Circular DNA）。,5,野生型質粒的大

2、小一般在2-200Kb 基因工程常用質粒在2-4Kb之間 質粒并不是細菌生長所必須的，但可為宿主執(zhí)行一定的遺傳功能，如抗生素的抗性、重金屬離子的抗性、細菌毒素的分泌等。,6,質粒 (plasmid),7,1 .質粒類型: 嚴緊型質粒(stringent plasmid) 1-5個拷貝/細胞,松弛型質粒(relaxed plasmid): 數十個/細胞 質粒在細胞中的拷貝數有時與寄主的種類有關。,8,2. 質粒載體必須具備的條件,（1）分子量相對較小，能在細菌內穩(wěn)定存在，有較高的拷貝數。 （2）具有一個以上的遺傳標志，便于對宿主細胞進行選擇，如抗生素的抗性基因，-半乳糖苷酶基因（Lac Z）等。

3、,9,（3）具有多個限制性內切酶的單一切點，便于外源基因的插入。如果在這些位點有外源基因的插入，會導致某種標志基因的失活，而便于篩選。,10,質粒性質 不相容性（不親和性） 具有相同或相似復制子結構及特征的兩種不同質粒，不能穩(wěn)定的存在于同一受體細胞內，這種現象稱作質粒的不相容性。,11,3. 質粒載體的選擇性標記,抗菌素抗性 新陳代謝特性,12,抗菌素名稱 抗菌素作用方式 宿主菌抗性機理,氨芐青霉素（Amp） 干擾細菌細胞壁合成 編碼-內酰胺酶,切割Amp -內酰胺環(huán) 氯霉素（Cml） 抑菌劑,與50S結合,干擾 編碼乙酰轉移酶,使氯霉素 蛋白質合成 乙?；Щ?卡那霉素（Kan） 殺菌劑,與

4、70S結合,mRNA 編碼氨基糖苷磷酸轉移酶, 發(fā)生錯讀 修飾Kan失活 鏈霉素（Sm） 殺菌劑,與30S結合,mRNA 編碼特異修飾酶 發(fā)生錯讀 四環(huán)素（Tet） 抑菌劑,與30S結合，阻止 編碼特異蛋白,修飾細菌膜 蛋白合成 結構,阻止Tet通過細胞膜,13,復制起點,氨芐青霉素抗性基因,14,常用的質粒載體,1.pBR322 2.220載體是我國預防醫(yī)學科學院病毒研究所自行構建的大腸桿菌溫控表達載體。 3.pUC系列:如pUC118、pUC119，兩者之間的差別在于多克隆位點不同。,15,16,17,18,4.融合表達載體 如GST融合表達系統(tǒng)。載體中含有細菌的谷胱甘肽巰基轉移酶（GST

5、）基因，外源基因克隆在GST基因的下游。當基因表達時，表達產物為GST與目的蛋白的融合體。,19,融合表達載體的優(yōu)點,表達效率高 融合蛋白易純化： 抗GST的蛋白質作為特異性抗體， 用親和層析法從細胞裂解液中純化出融合蛋白； 可從融合蛋白中分離出單一的外源蛋白質GST與外源蛋白之間克隆上蛋白酶的切割位點，可用適當的酶切割。,20,例如加裝一段編碼Ile-Glu-Gly-Arg寡肽序列的人工接頭片斷，該片斷可被具有蛋白酶活性的凝血因子a切割，從Arg后切開。目的蛋白中出現此種序列的可能性極小，因此該方法用途廣泛。,21,QIAexpress 6His表達系統(tǒng),重組蛋白質的末端帶有6個組氨酸殘基，

6、對帶有Ni離子的層析介質有高度的親和力，易于純化。 6個組氨酸殘基質量小，不影響蛋白質的結構和功能，無需切除。 6個組氨酸殘基免疫原性差，重組蛋白可以直接用做抗原。,22,第二節(jié) 噬菌體類 噬菌體是一類細菌病毒的總稱，英文名為Bacteriophage,簡稱phage。噬菌體可以在脫離寄主細胞的狀態(tài)下保持自己的生命，但必須依賴寄主細胞才能復制生長。,23,噬菌體（bacteriophage, phage）,噬菌體是感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒。 病毒的特性： 個體微小，可以通過細菌濾器 沒有完整的細胞結構，由蛋白質和核酸組成 專性細胞內寄生的微生物 可分為12個科,24,噬菌體

7、的生物學性狀,25,噬菌體的生物學性狀,形態(tài) 個體小，需用電子顯微鏡觀察 蝌蚪形、微球形和絲形,The black bars are size bars representing 100 nm.,26,27,28,用作克隆載體的噬菌體有兩類：一類是噬菌體，另一類是M13噬菌體。 野生型噬菌體經過改造，已衍生出100多種克隆載體。 噬菌體載體分為插入型和替換型(置換型)兩類。 目前應用較廣的是EMBL系列、gt系列和Charon系列等。,29,噬菌體 （lambda phage) 噬菌體是可以感染細菌的病毒，是大腸桿菌的溫和型噬菌體。由外殼蛋白與一個48.5kb的雙鏈線狀DNA分子組成。經過改造

8、形成的噬菌體載體有較高的轉化效率。,30,在噬菌體DNA分子雙鏈的5端，各有一段由12個核苷酸組成的互補的單鏈凸出序列，即通常所說的黏性末端。在寄主細胞內，會通過黏性末端的互補作用，形成環(huán)型雙鏈DNA分子。這種由黏性末端結合形成的雙鏈區(qū)段稱為cos位點。（cos : cohensive end site),31,3,CCCGCCGCTGGA,GGGCGGCGACCT,3,在黏性末端的12個堿基中，有10個是GC。通過堿基配對線性分子環(huán)化起來，由此形成的雙鏈區(qū)，叫做cos位點。,32,噬菌體基因組含50余個基因，功能相近的基因聚集成簇。有些基因對噬菌體的生長不是必須的，可以被外源DNA片段取代。

9、 噬菌體上有56種限制性內切酶的識別位點，約300余切點。比如BamHI分別在第5505、22346、27972、34499和41732處有識別位點。,33,噬菌體的生長途徑 噬菌體有溶原和溶菌兩種生長途徑。 溶原生長途徑是指噬菌體的DNA整合在宿主染色體上，隨宿主染色體的復制而復制。以原噬菌體的形式潛伏起來。一旦宿主細胞處于某種條件下時， 噬菌體的DNA脫離染色體，重新進入溶菌生長途徑。,34,溶菌生長是指噬菌體在宿主細胞中黏性末端連接，成為環(huán)形DNA分子，借用宿主細胞的體系，合成病毒包裝所需的外殼蛋白，新復制的DNA與外殼蛋白包裝成新的病毒顆粒。宿主細胞膜在R蛋白和S蛋白的作用下破裂，釋放

10、出大量子代噬菌體顆粒，感染新的細胞。,35,噬菌體的生活史,溶菌生長途徑 (lysis pathway) 溶源菌生長途徑 (lysogenic pathway),36,M13噬菌體,單鏈DNA,基因組含6407個堿基.經過基因改造后，形成M13mp系列。 可容納遠大于自身基因組的外源DNA,(7倍). M13噬菌體感染細胞后,不裂解宿主細胞,但妨礙宿主細胞的生長,因此可見培養(yǎng)平板上的混濁噬菌斑.,37,噬斑,38,單鏈的M13噬菌體（）進入受體菌后，以自身為模板，復制出互補鏈（），成為雙鏈的結構，稱為復制型DNA。復制型DNA在細胞內可達200個拷貝。此時， （）鏈被特異的蛋白質阻斷，不再生成

11、新的（）鏈。只能生成新的（）鏈。 （）鏈DNA被殼蛋白包裝組成病毒顆粒，擠出宿主細胞。,39,科斯質粒載體 （cosmid）,又稱粘粒載體，簡稱粘粒。 環(huán)形雙鏈DNA分子，一般為46Kb。 該載體含有DNA的cos序列（不少于280個bp）和pBR322質粒的序列。該載體轉化效率高。可容納高達45kb的外源DNA。以感染方式進入宿主細胞,在宿主體內象質粒那樣復制.,40,粘粒載體可像質粒一樣在細菌中繁殖，有的（pWE15/16）可以在哺乳動物中繁殖。又能像DNA一樣體外包裝，并高效導入受體細胞。 屬松弛型質粒，拷貝數較多。,41,42,農桿菌Ti質粒,根癌農桿菌含有一種內源質粒，當農桿菌與植物

12、接觸時，這種質粒會引發(fā)植物產生腫瘤，故名Ti質粒（tumor inducing plasmid）。 Ti質粒為雙鏈環(huán)狀DNA分子，200250Kb之間。 Ti質粒進入植物細胞的只是一小部分，約25kb，稱為T-DNA（transfer DNA）。,43,T-DNA兩端各有一個25bp的正向重復序列，在不同的Ti質粒中是高度保守的，該序列對于T-DNA的轉移和整合是不可缺少的。 利用大腸桿菌質粒與T-DNA的部分序列重組，構建Ti質粒克隆載體，可用于植物細胞的基因轉移。,44,第三節(jié) 酵母細胞基因工程載體 酵母是最簡單的單細胞真核生物。 酵母可對表達的多肽鏈進行加工和修飾，如二硫鍵的正確形成、糖

13、基化、除去N端的甲硫氨酸等。,45,酵母菌的克隆載體,YIP 酵母整合型質粒 YRP 酵母復制型質粒 YEP 酵母附加子型載體 CIP 酵母菌著絲粒型質粒,46,上述質粒均可在大腸桿菌和酵母菌中穩(wěn)定存在，即所謂的穿梭質粒。這些質粒含有兩種可供篩選的選擇性標記。,47,YIp載體,URA3 乳清苷酸脫羧酶,48,酵母菌表達載體1.選擇性標志 當使用大腸桿菌做為宿主細胞時，多使用抗生素抗性作為篩選標志。由于酵母菌對許多抗生素不敏感，故需要其他的篩選標志。野生型基因：URA3（尿嘧啶）、LEU2、HIS3、TRP1 （色氨酸） 這些基因可補償酵母菌細胞中某一種特定的代謝缺陷（營養(yǎng)缺陷）,49,2 .

14、啟動子,含有可被RNA聚合酶II識別的酵母啟動子 GAL、GAL10（半乳糖激酶） PHO5（堿性磷酸酶） ADH （醇脫氫酶） TP1 （丙糖磷酸異構酶） PGK （磷酸甘油酸激酶） GAP （磷酸甘油醛脫氫酶） SUC （蔗糖酶）,50,注釋：細胞內某些蛋白質豐度較高，如PGK （磷酸甘油酸激酶）、GAP （磷酸甘油醛脫氫酶），各占細胞總蛋白的5%，屬于高含量的蛋白質，它們的啟動子為強啟動子。,51,酵母分泌型表達載體,這類載體可以使目的蛋白分泌到細胞外。 載體內除含有一般表達質粒的必要成分外，還需有一個控制蛋白質分泌的信號序列。其編碼的多肽鏈叫做信號肽。信號肽內多含疏水性氨基酸。,52,

15、第四節(jié) 哺乳動物細胞表達載體,53,病毒侵入動物細胞后，有兩種生長狀態(tài) 溶細胞感染 病毒在宿主細胞內合成自身的核酸和結構蛋白，裝配成完整的子代病毒顆粒，釋放到細胞外，擴大感染，宿主細胞因為代謝障礙而死亡。 整合性感染 病毒核酸整合到宿主細胞的染色體中，隨細胞DNA的復制而擴增。,54,病毒載體： （1）含有能夠被真核細胞識別的有效啟動子 （2）在感染周期中能夠持續(xù)復制，達到很高的拷貝數。 （3）控制自己復制的元件 （4）有些載體可高效穩(wěn)定地整合到寄主基 因組上 （5）外殼蛋白識別細胞受體，可將外源基 因高效導入受體細胞。,55,1.SV40病毒載體,SV40：猿猴空泡病毒（Simian vac

16、uolating virus 40) 環(huán)型雙鏈DNA分子，含5243bp。 優(yōu)點：1.感染率高；2.拷貝數高；3.轉錄產物 高； 缺點：1.宿主范圍窄；2.最終導致感染細胞死 亡； 3.制備耗時，成本較高。,56,SV40病毒載體的改建 病毒的部分序列質粒的部分序列 如PSV2 包括 病毒的復制起始區(qū)、早期啟動子、 增強子序列、部分t抗原基因 pBR322的復制起始區(qū)、氨芐青霉素 抗性基因,57,病毒-質粒載體 病毒的早期區(qū)段和復制起點+大腸桿菌的質粒分子重組而成。 例如：pC10早期區(qū)段和復制起點（多瘤病毒）質粒pBR322的部分區(qū)段 這種載體既可在大腸桿菌中復制，也可在哺乳動物細胞中復制，

17、稱之為穿梭載體。,58,改造后的病毒優(yōu)缺點 優(yōu)點： 1.不需病毒顆粒的包裝過程，故可插入較大長 度的DNA片段。 2.不引起宿主細胞的裂解，可建立穩(wěn)定傳代的 細胞株。 3.整合到宿主細胞的染色體中，重組基因不會丟失。 缺點：轉染效率低于萬分之一。,59,受納細胞：SV40感染CV-1或AGMK猿猴細胞后，產生感染性病毒顆粒，并使宿主細胞裂解，這種感染稱為裂解感染，而猿猴細胞則稱為受納細胞。,60,非受納細胞：SV40感染倉鼠細胞后，不產生感染顆粒，病毒基因組整合到宿主細胞染色體上，細胞被轉化（癌變），這種嚙齒類動物細胞為SV40病毒的非受納細胞。,61,逆轉錄病毒載體 逆轉錄病毒是一類單鏈RN

18、A病毒。 宿主范圍廣，感染動物或人的細胞。 感染效率高，理論上可達100。 具有強啟動子。 不引起宿主細胞的死亡，可以維持許多代 存在問題：1.容量小，低于10kb。 2.可能引起細胞癌變。,62,腺病毒載體（AV） 線性雙鏈DNA病毒，經過改造的腺病毒載體，缺失了大部分的病毒基因，更加安全。,63,優(yōu)點：基因組大，可插入大片段的外源基因，最多可 達 35kb； 可高效的感染不同類型的人體組織細胞； 進入細胞內不整合進宿主的基因組，僅瞬間表達。 缺點 免疫原性強，可刺激機體產生免疫反應； 幾乎可感染所有的細胞，缺乏特異性。,64,腺相關病毒載體（AAV）：屬于非致病的微小 病毒科家族的成員，只

19、有依賴于輔助病毒才能繁殖。 特點： 基因組小，只有幾個kb； 無致病性； 免疫原性弱； 裝載外源基因容量小，不超過5kb； 制備過程復雜 ；,65,痘苗病毒載體：痘苗病毒是動物病毒中最大的一種，與天花病毒有密切的親緣關系。長期被用作預防天花的疫苗。 病毒基因組中有很大的非必需區(qū)（28kb），可以切除，代之以較大的外源基因，或者同時插入幾個外源基因，構成多價疫苗。,66,哺乳動物細胞基因轉移的選擇標記,氨基糖苷磷酸轉移酶：G418 二氫葉酸還原酶（DHFR）MTX（氨甲喋呤） 胸苷激酶（TK）： APT （氨基喋呤） 潮霉素-B-磷酸轉移酶（HPH）：潮霉素-B 黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（X

20、GPRT）：霉酚酸 腺嘌呤核糖脫氨酶（ADA）：,67,嘌呤和嘧啶合成知識的回顧 哺乳動物細胞內的兩條合成途徑 1 從頭合成：利用各種小分子，如氨基酸、CO2、NH3、磷酸核糖等，合成嘌呤或嘧啶環(huán)，進而合成核苷酸。 2 補救合成途徑：利用細胞內原有的或從胞外吸收的堿基、核苷、核苷酸。,68,1.從頭合成途徑：利用小分子,合成核苷酸，包括胸苷酸,2.補救合成途徑： 利用細胞內現有的堿基、磷酸,合成核苷酸，包括胸苷酸,氨甲喋呤可阻擋此途徑,胸苷激酶等,69,當培養(yǎng)基中混有氨基喋呤時，會干擾細胞從頭合成嘌呤和嘧啶的代謝途徑。TK+細胞可利用環(huán)境中的胸苷合成胸苷一磷酸，由此可以存活。而TK-細胞不能利

21、用環(huán)境中的胸苷合成胸苷一磷酸，因而死亡。,70,如 胸苷,胸苷激酶 TK,胸苷一磷酸,若一細胞株缺乏胸苷激酶，則標示為TK細胞，此種細胞若被置于混有氨基喋呤和胸苷的培養(yǎng)基中，將無法存活。而TK陽性細胞可存活。 當TK細胞轉入了外源的胸苷激酶基因，則在混有氨基喋呤和胸苷的培養(yǎng)基中，可正常生長。,71,第五節(jié) 昆蟲細胞表達載體,桿狀病毒是許多昆蟲的天敵，應用桿狀病毒作為昆蟲細胞表達載體，用途越來越廣。 基因組特點：較大，約100150kb，其中的多角體蛋白編碼基因是復制的非必需區(qū)，啟動子功能強大?？蓪⑼庠椿虿迦肫鋬取?后又發(fā)現最晚期表達的一種蛋白質，其編碼基因也是復制非必需區(qū)，可用作外源基因插入區(qū)域。,72,桿狀病毒載體的優(yōu)點,1. 容量大，外源基因可達100kb