1、四個階段：一、以導(dǎo)致遺傳病的基因突變位點(diǎn)為靶標(biāo)，以DNA分子雜交為核心二、以PCR技術(shù)為核心三、以生物芯片為核心四、以DNA測序技術(shù)為核心廣義：分子標(biāo)志物包括基因組DNA、各種RNA、蛋白質(zhì)和各種代謝物臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)靶標(biāo)主要以核酸（DNA和RNA）為主基因組DNA是臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)中最常用的分子靶標(biāo)病原生物基因1.菌種鑒定：PCR-測序和PCR-DNA探針雜交;縮短檢測時間 2.確定病毒感染和病毒載量：明確感染源，判斷病情，監(jiān)測療效3.病毒分析：基因型變異產(chǎn)生不同臨床癥狀4.細(xì)菌耐藥監(jiān)測和分子流行病學(xué)調(diào)查 ：隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA；指導(dǎo)選擇治療方案，控制病原菌的感染傳播基因變異1.致病基因

2、的分子缺陷 2.線粒體基因突 3.腫瘤相關(guān)基因 單基因病1.致病基因結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，影響了編碼產(chǎn)物量和質(zhì)的改變，如血紅蛋白病、血友病、Duchenne肌營養(yǎng)不良等。2.致病基因中核苷酸三聯(lián)體重復(fù)序列發(fā)生高度擴(kuò)展，如脆性X綜合征、亨廷頓病、強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良等。 基因多態(tài)性用于：1.基因定位和疾病相關(guān)性分析2.疾病診斷和遺傳咨詢3.多基因病的研究4.器官移植配型和個體識別循環(huán)游離核酸檢測（包括游離DNA和游離RNA）用于：產(chǎn)前診斷、惡性腫瘤早期診斷、病例檢測臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)以分子雜交技術(shù)、PCR技術(shù)和DNA測序技術(shù)、芯片技術(shù)、雙向電泳技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)為主要技術(shù)分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)可用于微生

3、物感染的確診、感染性病原體的分型、耐藥監(jiān)測。分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)有利于臨床上對遺傳性疾病的早期預(yù)防、早期診斷、早期治療。重要國際生物信息中心：1.美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）2.歐洲生物信息學(xué)研究所(EBI) 3.日本國立遺傳研究所（DDBJ）一級核酸數(shù)據(jù)庫有GenBank、EMBL和DDBJ；蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫有SWISS-PROT、PIR、UNIPROT等。蛋白質(zhì)X射線晶體三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫有PDB等。蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫常用的有SWISS-PROT、 PIR、 PDB數(shù)據(jù)庫。二級數(shù)據(jù)庫非常多，如人類基因組圖譜庫GDB、轉(zhuǎn)錄因子和結(jié)合位點(diǎn)庫TRANSFAC、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)家族庫SCOP等。*乙型肝炎病

4、毒核酸的檢測常用技術(shù)：1.普通PCR技術(shù)2.熒光定量PCR技術(shù)3. 支鏈DNA技術(shù)4. 核酸雜交技術(shù)5.雜交捕獲系統(tǒng)6.基因芯片技術(shù)*HBV基因分型的方法： 1,PCR-RFLP 2.PCR-RBD 3.ELISA 4.基因芯片人乳頭瘤病毒基因組結(jié)構(gòu) ： HPV DNA 為一雙鏈閉環(huán)分子，基因組可分三個區(qū)段：早期區(qū)（E）、晚期區(qū)（L）、長控制區(qū)或上游調(diào)節(jié)區(qū)或非編碼區(qū)。*HPV DNA檢測及基因分型： 1.核酸雜交技術(shù)（主要包括核酸印跡、原位雜交、雜交捕獲等技術(shù)。目前常采用HC 技術(shù)、核酸分子雜交與PCR相結(jié)合的方法。具有較強(qiáng)的特異性，并可分型） 2.PCR技術(shù)* （采用型特異性引物進(jìn)行HPV快

5、速分型，現(xiàn)已成為HPV感染最常用的檢測方法之一。目前常用通用引物-PCR（GP-PCR）和實(shí)時定量PCR。1. GP-PCR，依據(jù)不同HPV亞型有共同保守序列的特點(diǎn)來設(shè)計通用引物，可廣譜擴(kuò)增HPV DNA，具有較高的敏感性，可檢測出10-400拷貝的HPV病毒含量。在GP-PCR的基礎(chǔ)上，建立了巢式PCR和巢式多重PCR檢測HPVDNA。提高了檢測敏感性和多重感染率。2.實(shí)時定量PCR法，該法可實(shí)現(xiàn)HPV DNA定量和快速檢測。 現(xiàn)在市售產(chǎn)品可以檢測E6和E7的mRNA；進(jìn)行HPV16、18、31、33與45分型。檢測靈敏度高，但設(shè)備昂貴，操作繁瑣，不適于宮頸癌的大規(guī)模篩查。） 3.基因芯片技

6、術(shù)（基因芯片可對HPV進(jìn)行分型和多重感染診斷，適于高通量HPV篩查 ）4.流式熒光液芯技術(shù) 5.飛行時間質(zhì)譜技術(shù) 臨床意義：（一）宮頸疾病風(fēng)險預(yù)測（二）療效評估及術(shù)后跟蹤（三）預(yù)防控制和疫苗研發(fā)*HIV-1基因組中，gag、pol、env為結(jié)構(gòu)基因，編碼病毒核心蛋白(gag)、多聚酶(pol)、和外膜蛋白(env)。vpr、rev、vif、tat、vpuvpx、nef等6個基因?yàn)檎{(diào)控基因，編碼調(diào)控蛋白和輔助蛋白。核酸序列依賴擴(kuò)增（NASBA）是一種等溫擴(kuò)增RNA的技術(shù)， 能直接擴(kuò)增單鏈RNA特異序列，通過合成cDNA，在等溫條件下進(jìn)行體外序列特異性核酸擴(kuò)增。NASBA需要AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核

7、酸酶H、噬菌體T7RNA聚合酶共同作用完成。NASBA分非循環(huán)相(模板RNA 與引物互補(bǔ))和循環(huán)相(轉(zhuǎn)錄的反義RNA 與引物 互補(bǔ))兩個階段流行性感冒病毒核酸檢測：主要有RT-PCR、實(shí)時熒光定量RT-PCR、基因芯片、逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（RT-LAMP）等。結(jié)核分枝桿菌核酸的檢測: 1.PCR 2.Real-time PCR 3. PCR-RFLP 4. 線性探針雜交法（LPA） 5.鏈替代擴(kuò)增技術(shù)（SDA） 6.擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌直接試驗(yàn)（AMTDT） 7.基因芯片技術(shù) 8.GeneXpert全自動結(jié)合檢測平臺結(jié)核分枝桿菌的耐藥性檢測:（1）DNA測序 （2）PCR-SSCP （3）PC

8、R-RFLP （4）PCR-RDB （5）基因芯片技術(shù) 淋病奈瑟菌核酸的檢測: 1.PCR 2.實(shí)時熒光定量 PCR技術(shù) 3. 連接酶鏈反應(yīng) 4.連替代擴(kuò)增技術(shù)（SDA） 淋病奈瑟菌的主要耐藥基因:（1）gyrA和parC基因 （2）pen A、ponA基因 （3）porB基因 （4）Mtr系統(tǒng)調(diào)控基因 （5）erm基因 淋病奈瑟菌耐藥檢測的分子生物學(xué)技術(shù): （1）DNA測序 （2）PCR-SSCP （3）PCR-RFLP （4）基因芯片技術(shù) *醫(yī)院細(xì)菌感染的常用分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù): 1.脈沖場凝膠電泳(PFGE）被認(rèn)為是菌株分子分型的“金標(biāo)準(zhǔn)” 2. PCR-RFLP 3.擴(kuò)增限制性片段長度

9、多態(tài)性分析 (AFLP) 4. 重復(fù)序列PCR 5. 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù) 6. 多位點(diǎn)測序分型 白假絲酵母菌的分子生物學(xué)檢驗(yàn)： 1.PCR 普通PCR、實(shí)時PCR、巢式PCR和多重PCR等 2. PCR-斑點(diǎn)雜交 3. DNA指紋技術(shù)，包括RFLP、隨即擴(kuò)增多態(tài)性分析（RADP）、電泳核型分析等 4. AP-PCR 5.DNA序列分析 6.基因芯片技術(shù) 新型隱球菌的分子生物學(xué)檢驗(yàn)：1.PCR 2. 斑點(diǎn)雜交 3. PCR-RFLP 沙眼衣原體的分子生物學(xué)檢驗(yàn)：1.PCR 2. 連接酶鏈反應(yīng) 3. DNA序列分析 肺炎衣原體的分子生物學(xué)檢驗(yàn)：PCR、實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)、巢式PCR和競爭

10、性PCR肺炎支原體的分子生物學(xué)檢驗(yàn)：1.PCR 2. 核酸雜交，探針有特異性DNA片段探針、人工合成的寡核苷酸探針、全DNA探針。常用斑點(diǎn)雜交。3. PCR-RFLP 梅毒螺旋體的分子生物學(xué)檢驗(yàn)：1.PCR 2. 核酸雜交 3. PCR-RFLP 分子生物學(xué)檢驗(yàn)可早期診斷患者的梅毒感染，及時治療，防止病情惡化與蔓延。另外是耐藥基因分析和流行病學(xué)研究的首選方法。弓形蟲DNA主要有三種形式：染色體DNA、線粒體DNA、和胞質(zhì)DNA 利用分子生物學(xué)技術(shù)已檢出弓形蟲的主要基因有B1基因、P22基因（SAG2）、P30基因（SAG1）、 P43（SAG3）和棒狀體蛋白1（ROP1）等。 分生檢測：1.P

11、CR 主要側(cè)重檢測B1基因和P30基因。 2. 斑點(diǎn)雜交 珠蛋白合成障礙性貧血的分子生物學(xué)檢驗(yàn) 1.PCR 2.Southern印跡雜交 3.AS-PCR 4. SSCP 5.gap-PCR 珠蛋白生成障礙性貧血的分子生物學(xué)檢驗(yàn)：PCR-RDB、PCR-RFLP、基因芯片、PCR-ASO、AS-PCR血友病B的分子生物學(xué)檢驗(yàn)： 直接檢測法有Southern印跡雜交、DNA測序、基因芯片和毛細(xì)管電泳； 間接檢測方法有RFLP、SSCP、變性梯度凝膠電泳(DGGE) 、雙脫氧指紋圖譜、變性高效液相色譜（DHPLC）。 脆性X綜合征的分子生物學(xué)檢驗(yàn)： （一）Southern印跡雜交 （二）PCR （

12、三）微衛(wèi)星序列分析 通過分子診斷FMR-1基因突變開展患者判定、攜帶者篩查、產(chǎn)前診斷和群體篩查等。 腫瘤相關(guān)的基因: 原癌基因、抑癌基因、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因、細(xì)胞凋亡基因以及維持細(xì)胞基因組穩(wěn)定性基因等。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因: 周期蛋白（cyclins）、周期蛋白依賴性激酶（CDKs）、CDK抑制因子（CKIs）及細(xì)胞周期檢查點(diǎn)等其他蛋白細(xì)胞凋亡相關(guān)基因可分三類：促細(xì)胞凋亡基因、抑制細(xì)胞凋亡基因、細(xì)胞凋亡過程中表達(dá)的基因。 p53是研究的較為充分的與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系明確的抑癌基因，絕大多數(shù)腫瘤都伴有p53基因的突變。乳腺癌（17號染色體長臂上）的發(fā)生、發(fā)展緊密聯(lián)系的基因有BRCA1、BRCA2、TP

13、53、c-erbB2、c-Myc、P53、Bcl-2、BAX、iASPP、ATM、MDM-2以及PTEN等乳腺癌的分子生物學(xué)檢驗(yàn)： 1.雌激素受體（ER）和孕激素受體（PR）檢測（免疫組織化學(xué)） 2.c-erbB-2/HER2檢測 （免疫組化、熒光原位雜交） 3. PS2檢測 4. Ki67檢測 5. 乳腺癌復(fù)發(fā)基因檢測 （DNA微集陣列技術(shù)、多基因RT-PCR定量檢測技術(shù)）（70基因檢測方法、21基因檢測方法）遺傳性結(jié)直腸癌相關(guān)基因：結(jié)腸腺瘤性息肉?。ˋPC）基因 、DNA錯配修復(fù)（MMR）基因、微衛(wèi)星異常微衛(wèi)星異常主要表現(xiàn)為：微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）；微衛(wèi)星雜合性丟失（LOH）。結(jié)直腸癌的

14、分子生物學(xué)檢驗(yàn)：1.HNPCC的篩查2. 微衛(wèi)星異常檢測3. APC基因突變檢測4. DCC基因突變檢測5. DNA甲基化的檢測6. 結(jié)直腸癌個體化治療的相關(guān)檢測 白血病相關(guān)基因突變 ：C-KIT、FLT3、 NPM（核仁磷酸蛋白）、N-RAS、 NOTCH1 白血病相關(guān)基因表達(dá)異常 ：WT1、HOX11、白血病融合基因。（WT1可作為不伴特異分子異常的AML微小殘留白血?。∕RD）的理想檢測指標(biāo)）白血病的分子生物學(xué)檢驗(yàn)：FISH、PCR、RT-PCR、實(shí)時定量PCR（FISH適于多種臨床標(biāo)本，但靈敏度不及PCR，主要用于初診和復(fù)發(fā)的檢測。）線粒體12SrRNA基因的A1555G和C1494T

15、突變是導(dǎo)致氨基糖苷類抗生素耳毒性的主要分子致病基礎(chǔ)。tRNASer(UCN)T7511C等突變則與非綜合征型耳聾相關(guān)；而tRNALeu(UUR)A3243G等突變可導(dǎo)致綜合征型耳聾。 耳聾相關(guān)的mtDNA突變的檢測：1.PCR-RFLP 2.DHPLC 3.DNA測序 4.基因芯片LHON（Leber遺傳性視神經(jīng)病變）相關(guān)的mtDNA突變位點(diǎn)的檢測方法有PCR-RFLP、PCR-SSCP、DHPLC、DNA測序、熒光定量PCR、AS-PCR、及基因芯片等tRNALeu(UUR)A3243G仍是目前國際上唯一公認(rèn)的線粒體糖尿病致病突變線粒體糖尿病的分子生物學(xué)方法：PCR-DHPLC、PCR-RF

16、LP、PCR-測序、熒光定量PCR、基因芯片等。染色體結(jié)構(gòu)異常類型有缺失、重復(fù)、倒位、等臂染色體、環(huán)狀染色體、易位等類型。染色體疾病常用的分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)：FISH、MLPA、CGH 、無損傷產(chǎn)前染色體病分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)藥物相關(guān)基因分類：藥物作用靶點(diǎn)相關(guān)基因、藥物代謝酶基因（CYP450、N-乙?；D(zhuǎn)移酶）、藥物副反應(yīng)相關(guān)基因植入前遺傳學(xué)診斷（PGD）：PCR及其相關(guān)技術(shù)、多色熒光原位雜交技術(shù)、全基因組擴(kuò)增及基因芯片等相繼應(yīng)用于PGD。PGD最早適用于包括性別診斷、某些單基因遺傳病、染色體結(jié)構(gòu)與數(shù)目異常等植入前遺傳學(xué)診斷（PGD）常用的分子生物學(xué)技術(shù)：單細(xì)胞PCR技術(shù)、熒光原位雜交 、植入

17、前遺傳學(xué)單倍型分析（PGH）技術(shù)、非整倍體篩選（PGS）分子生物學(xué)技術(shù)在HLA分型中的應(yīng)用（DNA分型技術(shù)）：1.RFLP與PCR-RFLP技術(shù) 2.PCR-SSCP技術(shù) 3.測序技術(shù) 4.PCR-SSO技術(shù) 5.PCR-SSP技術(shù) 6.基因芯片技術(shù)7.流式細(xì)胞儀技術(shù) 8.氨基酸殘基配型標(biāo)準(zhǔn)分型技術(shù) 測序技術(shù)（是最可靠、最直接、最準(zhǔn)確的HLA分型方法）法醫(yī)物證學(xué)主要內(nèi)容包括：個體識別、親子鑒定、性別鑒定、種族和種屬認(rèn)定。核酸標(biāo)志物存在多種不同的形式，包括基因突變位點(diǎn)、基因多態(tài)性位點(diǎn)、等位基因、mRNA、mircoRNA、線粒體DNA、病原生物基因組DNA、DNA甲基化位點(diǎn)和循環(huán)核酸等。熒光原位

18、雜交技術(shù)（FISH）的原理：將標(biāo)記的核酸探針變性后，利用探針與被檢樣本上已變性的靶核酸序列在退火溫度下復(fù)性，進(jìn)行分子雜交，對大的靶序列（1kb）采用直接標(biāo)記的熒光探針，對于小的靶核酸序列以及弱雜交信號通過生物素或地高辛標(biāo)記核酸探針，在用熒光標(biāo)記的配體（如抗體）進(jìn)行雜交信號放大，最后用熒光顯微鏡觀察熒光信號，在不改變被檢標(biāo)本（即維持其原位）的情況下對靶核酸序列進(jìn)行定位、定性與半定量分析。（用于FISH的探針可以是DNA或RNA，核酸探針的標(biāo)記方法可用缺口翻譯法、隨機(jī)引物法、PCR法或體外轉(zhuǎn)錄法）FISH是一種非放射性原位雜交，其原理是將標(biāo)記了熒光的探針與固定在載玻片上細(xì)胞染色體或染色質(zhì)的特異部位

19、進(jìn)行原位雜交，然后用熒光顯微鏡在不同波長的激發(fā)光下觀察，判斷特定染色體的數(shù)目或其存在或缺失的情況。具有簡單、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。熒光原位雜交技術(shù)的方法特點(diǎn)：1.簡便、穩(wěn)定、直觀、省時 2.檢測結(jié)果的局限性 FISH檢測的一般過程 標(biāo)本玻片的制備；標(biāo)本預(yù)處理；探針和標(biāo)本的變性；原位雜交；雜交后的洗滌和復(fù)染；FISH信號分析。多重連接依賴性探針擴(kuò)增（MLPA）：利用多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)檢測與探針雜交和連接反應(yīng)的組合，可在同一反應(yīng)管內(nèi)同時檢測被檢樣本4050個不同的DNA或RNA序列的拷貝數(shù)變化。MLPA技術(shù)的原理：樣本的每個被檢測位點(diǎn)包括兩個特異的寡核苷酸片段探針，一個由化學(xué)合成（5端探針，如圖1A和2A），另一個通常經(jīng)M13噬菌體衍生法制備（也可由化學(xué)合成法合成，探針設(shè)計略有不同）的探針（3端探針，1B和2B），5端探針包括探針5端一段通用引