1、發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌,發(fā)酵的一般流程,發(fā)酵設(shè)備發(fā)酵罐,發(fā)酵罐的特點(diǎn) 軸封嚴(yán)密，泄漏少 能承受一定壓力、溫度 攪拌通風(fēng)裝置保證氣液充分混合 具有足夠的冷卻面積 死角少，滅菌徹底 適宜的徑高比（高與直徑的比值為2.54）,發(fā)酵罐的類型 攪拌釜反應(yīng)器 鼓泡式反應(yīng)器 氣升式反應(yīng)器,發(fā)酵輔助設(shè)備,無菌空氣系統(tǒng) 無菌空氣的要求 滅菌系統(tǒng)、管道、閥門,培養(yǎng)基及其滅菌,培養(yǎng)基（medium） 培養(yǎng)基的成分 碳源、氮源、無機(jī)鹽、前體物、促進(jìn)劑、抑制劑,培養(yǎng)基的類型 按組成 按狀態(tài) 按用途,培養(yǎng)基滅菌 空罐滅菌 實(shí)罐滅菌 連續(xù)滅菌：高溫短時(shí),第四節(jié) 發(fā)酵工程制藥的過程與控制,種子的擴(kuò)大培養(yǎng),微生物發(fā)酵方式,分批發(fā)酵

2、 補(bǔ)料分批發(fā)酵 半連續(xù)發(fā)酵 連續(xù)發(fā)酵,發(fā)酵過程中的中間分析項(xiàng)目,產(chǎn)物產(chǎn)量 pH 糖 氨基氮 菌絲形態(tài),發(fā)酵過程的影響因素及控制,菌體濃度 營養(yǎng)物質(zhì) 溫度 pH 溶氧 泡沫 染菌 發(fā)酵終點(diǎn)的判斷,菌體濃度 在適合的生長(zhǎng)速率下，發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)率與菌體濃度成正比關(guān)系。特別是初級(jí)代謝產(chǎn)物。 菌體濃度過低，產(chǎn)物產(chǎn)率下降。 菌體濃度過高，產(chǎn)生其他影響。 措施：調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)的濃度。,營養(yǎng)物質(zhì) 碳源 氮源 磷酸鹽：生長(zhǎng)亞適量濃度 補(bǔ)料：半饑餓狀態(tài),溫度 考慮菌種及生長(zhǎng)階段 綜合考慮其他培養(yǎng)條件 考慮菌種生長(zhǎng)情況 發(fā)酵熱,pH 補(bǔ)加酸或堿和補(bǔ)料的方式,溶氧和CO2 溶氧異常下降 溶氧異常上升 措施,泡沫

3、 負(fù)面影響 措施,染菌 發(fā)酵前期染菌 發(fā)酵后期染菌,發(fā)酵終點(diǎn)的判斷 提高產(chǎn)物的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益 降低生產(chǎn)成本 主要指標(biāo)與中間分析項(xiàng)目雷同,第五節(jié) 發(fā)酵工業(yè)中的 代謝調(diào)控,代謝調(diào)控,運(yùn)用人為的方法對(duì)微生物的代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)進(jìn)行遺傳改造和條件的控制，在保證微生物適當(dāng)生長(zhǎng)的條件下，建立新的代謝方式，以期按照人們的意志有目的地過量積累所需的代謝產(chǎn)物，提高生產(chǎn)效率。,初級(jí)代謝,能使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)變成機(jī)體的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和對(duì)機(jī)體具有生理活性作用的物質(zhì)，或是為機(jī)體生長(zhǎng)提供能量的一類代謝。,次級(jí)代謝,存在于某些生物中（如某些植物和微生物），并在一定的生長(zhǎng)期內(nèi)出現(xiàn)的一類代謝。在抵御惡劣環(huán)境、偽裝躲避、清除自身毒素和排泄物時(shí)很重

4、要。,微生物初級(jí)代謝與次級(jí)代謝的關(guān)系,多糖、蛋白質(zhì)、脂肪、無機(jī)鹽,初級(jí)代謝中間產(chǎn)物（單糖、氨基酸、核苷酸、脂肪酸）,蛋白質(zhì)、核酸、粘多糖、脂多糖等生物大分子,分解 合成,分解代謝,生物合成,生長(zhǎng),抗生素、生物堿、色素、毒素等次級(jí)代謝產(chǎn)物,代謝產(chǎn)物合成的調(diào)控,初級(jí)代謝對(duì)次級(jí)代謝的調(diào)節(jié) 碳代謝物的調(diào)節(jié) 氮代謝物的調(diào)節(jié) 磷酸鹽的調(diào)節(jié) ATP的調(diào)節(jié) 誘導(dǎo)物調(diào)節(jié) 末端產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié) 細(xì)胞膜通透性調(diào)節(jié) 其他：金屬離子、溶解氧等的調(diào)節(jié),初級(jí)代謝對(duì)次級(jí)代謝的調(diào)節(jié),次級(jí)代謝產(chǎn)物以初級(jí)代謝產(chǎn)物為母體衍生而來。 次級(jí)代謝產(chǎn)物合成反應(yīng)的酶由初級(jí)代謝途徑的酶演化而來。 因此，初級(jí)代謝終產(chǎn)物的過量往往會(huì)抑制次級(jí)代謝產(chǎn)物的

5、合成。,碳代謝物的調(diào)節(jié),葡萄糖效應(yīng) 解除方法 變更速效碳源和遲效碳源的配比； 流加葡萄糖。,氮代謝物的調(diào)節(jié),分解代謝物阻遏效應(yīng) 解除方法 變更速效氮源和遲效氮源的配比； 流加無機(jī)氮。,磷酸鹽的調(diào)節(jié),磷酸鹽效應(yīng)：類似于葡萄糖效應(yīng) 機(jī)制： 促進(jìn)初級(jí)代謝、抑制次級(jí)代謝 抑制次級(jí)代謝產(chǎn)物前體的形成 阻遏某些關(guān)鍵酶的合成 抑制某些關(guān)鍵酶的活性 增加菌體能荷狀態(tài),ATP的調(diào)節(jié),直接影響次級(jí)代謝產(chǎn)物合成和糖代謝中某些酶的活性。 如四環(huán)素的合成。,誘導(dǎo)物調(diào)節(jié),某些參與次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的酶為誘導(dǎo)酶。 需有誘導(dǎo)物存在，誘導(dǎo)酶才能形成。 如甲硫氨酸誘導(dǎo)頭孢菌素C。,末端產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié),末端產(chǎn)物抑制合成途徑中的第一個(gè)

6、酶的活性，從而降低產(chǎn)物合成代謝的能力。 原位產(chǎn)物分離偶聯(lián)技術(shù)（in situ product removal，ISPR）,細(xì)胞膜通透性調(diào)節(jié),利于代謝產(chǎn)物分泌到胞外，減少胞內(nèi)濃度，從而避免末端產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)。 如：谷氨酸的生產(chǎn)，采取控制生物素濃度、添加青霉素、添加吐溫80等表面活性劑、選育油酸缺陷型菌株等方法。,抗生素的發(fā)酵生產(chǎn),抗生素的定義,生物在其生產(chǎn)活動(dòng)過程中所產(chǎn)生，并能在低微濃度下有選擇性地抑制或殺滅其他微生物或腫瘤細(xì)胞的有機(jī)物。,發(fā)展歷史,1929年，英國弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素。二戰(zhàn)期間，大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，世界上最早用于臨床的抗生素 。 20世紀(jì)60-70年代，利用生物合成和半合成方法研制抗生

7、素衍生物。 20世紀(jì)80年代至今，根據(jù)作用機(jī)理理性篩選階段，包括耐藥篩選模型等。,抗生素的分類,根據(jù)抗生素的生物來源分 根據(jù)抗生素的作用對(duì)象分 根據(jù)抗生素的作用機(jī)制分 根據(jù)抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)分,根據(jù)抗生素的生物來源分,放線菌產(chǎn)生的抗生素：鏈霉素、四環(huán)素、紅霉素 真菌產(chǎn)生的抗生素：青霉素、頭孢菌素 細(xì)菌菌產(chǎn)生的抗生素：多粘菌素、桿菌肽,根據(jù)抗生素的作用對(duì)象分,抗G+的抗生素：青霉素、紅霉素 抗G-的抗生素：鏈霉素、多粘菌素 廣譜抗生素：氨芐青霉素 抗真菌抗生素：兩性霉素 抗病毒和噬菌體抗生素：氯霉素、艾霉素 抗原蟲抗生素：滅滴蟲素 抗癌抗生素：阿霉素、博萊霉素,根據(jù)抗生素的作用機(jī)制分,抑制細(xì)胞壁合

8、成：青霉素、頭孢菌素 抑制細(xì)胞膜功能：多粘菌素 干擾蛋白質(zhì)合成：四環(huán)素 抑制核酸合成 ：博萊霉素、利福霉素 抑制生物能作用：抗霉素,根據(jù)抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)分,-內(nèi)酰胺類：青霉素類、頭孢菌素類 氨基糖苷類：鏈霉素、慶大霉素 大環(huán)內(nèi)酯類：紅霉素、麥迪加霉素 四環(huán)類：四環(huán)素、土霉素 多肽類：多粘菌素,natural penicillin R =,CH2-CO-,-內(nèi)酰胺類抗生素的結(jié)構(gòu)特征,氨芐青霉素,甲氧苯青霉素,羧芐青霉素,苯唑西林,大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)類抗生素的結(jié)構(gòu)特征,-內(nèi)酰胺類抗生素的生物合成,L-氨基己二酸 + L-半胱氨酸 + L-纈氨酸,ACV三肽,ACV合成酶,異青霉素N(IPN),異青霉

9、素合成酶,6-APA,青霉素N，,青霉素G,頭孢菌素C,-內(nèi)酰胺類抗生素的代謝調(diào)控,碳源分解代謝物阻遏 賴氨酸的反饋調(diào)節(jié)：共同中間體 L-甲硫氨酸對(duì)頭孢菌素C的誘導(dǎo)作用 頭孢菌素C的擴(kuò)環(huán)/羥化雙功能酶需Fe2+，分子氧等輔助因子 纈氨酸是青霉素生物合成的前體,青霉素的發(fā)酵生產(chǎn),工藝流程,工藝控制要點(diǎn),生產(chǎn)種子的制備 絲狀菌的生產(chǎn)種子是由保藏在低溫的冷凍安瓿管經(jīng)甘油、葡萄糖、蛋白胨斜面移植到小（大）米固體培養(yǎng)基上，25培養(yǎng)7天，真空干燥并以這種形式保存?zhèn)溆谩Ｉa(chǎn)時(shí)按10%接種量移種到含有葡萄糖、玉米漿、尿素為主的種子罐內(nèi)，26培養(yǎng)至 菌絲濃度達(dá)6-8%，菌絲形態(tài)正常，按 10-15%的接種量移入

10、含有花生餅粉、葡萄糖為主的二級(jí)種子罐內(nèi)，27培養(yǎng) 至菌絲濃度10-12%，形態(tài)正常，即可作為發(fā)酵種子。,培養(yǎng)基成分的控制,碳源 產(chǎn)黃青霉菌可利用的碳源有乳糖、蔗糖、葡萄糖等。目前生產(chǎn)上普遍采用的是淀粉水解液、糖化液為碳源，進(jìn)行連續(xù)流加的方式。,氮源 氮源常選用玉米漿、精制棉籽餅粉、麩皮，并補(bǔ)加無機(jī)氮源（硫酸氨、氨水或尿素）。,前體 生物合成含有芐基基團(tuán)的青霉素G，需在發(fā)酵液中加入前體。前體可用苯乙酸、苯乙酰胺，一次加入量不大于0.1%，并采用多次加入，以防止前體對(duì)青霉素的毒害。,無機(jī)鹽 加入的無機(jī)鹽包括硫、磷、鈣、鎂、鉀等, 且用量要適度。另外，由于鐵離子對(duì)青霉菌有毒害作用, 必須嚴(yán)格控制鐵離

11、子的濃度，一般控制在30 g/ml 。,發(fā)酵培養(yǎng)的控制,加糖控制 加糖量的控制是根據(jù)殘?zhí)橇考鞍l(fā)酵過程中的 pH 值確定。最好是根據(jù)排氣中CO2量及 O2 量來控制， 一般在殘?zhí)墙抵?0.6% 左右，pH 值上升時(shí)開始加糖。 加糖率：0.07-0.15%，每2h一次或連續(xù)流加。,補(bǔ)氮及加前體,補(bǔ)氮是指加硫酸銨、氨水或尿素。發(fā)酵60-70開始補(bǔ)加，使發(fā)酵液氨基氮控制在0.01%-0.05%。 發(fā)酵8-12h后補(bǔ)前體，以使發(fā)酵液中殘存苯乙酰胺濃度為0.05%-0.08% 。,pH 值控制,一般為 pH6.5-6.9，盡量避免超過pH7.0。 pH上升可以補(bǔ)加葡萄糖或天然油脂來控制； pH下降則提高通

12、氣量，或補(bǔ)加氨水和碳酸鈣來控制。 目前生產(chǎn)上趨于采用直接加酸或加堿自動(dòng)控制pH。,溫度控制,前期 25- 26，后期 23，以減少后期發(fā)酵液中青霉素的降解破壞。,溶解氧和攪拌速率的控制,一般要求發(fā)酵中溶解氧量不低于飽和溶解氧的30%。通風(fēng)比一般為1:0.8vvm。 攪拌轉(zhuǎn)速在發(fā)酵各階段應(yīng)根據(jù)需要而調(diào)整。,泡沫的控制,在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量泡沫，可以用天然油脂，如豆油、玉米油等或用化學(xué)合成消泡劑“泡敵”來消泡，應(yīng)當(dāng)控制其用量并要少量多次加入，尤其在發(fā)酵前期不宜多用，否則會(huì)影響菌體的呼吸代謝。,發(fā)酵液質(zhì)量控制,生產(chǎn)上按規(guī)定時(shí)間從發(fā)酵罐中取樣，用顯微鏡觀察菌絲形態(tài)變化來控制發(fā)酵。生產(chǎn)上慣稱“鏡檢”，根據(jù)“鏡檢”中菌絲形變化和代謝變化的其他指標(biāo)調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度，通過追加糖或補(bǔ)加前體等各種措施來延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，以獲得最多青霉素。,青霉素的提取純化工藝,發(fā)酵液的過濾和預(yù)處理,低溫 過濾：鼓式過濾或板框過濾 雜蛋白去除：硫酸調(diào)pH4.5-5.0，0.07%絮凝劑PPB和0.07%硅藻土二次過濾。,萃取,乙酸丁酯（BA）二次萃取法 一次萃?。簆H1.8-2.2，濃縮倍數(shù)1.5-2.0。 反萃取：pH6.8-7.2，濃縮倍數(shù)3-4。 二次萃?。?pH1.8-2.2，濃縮倍數(shù)2-2.5。 萃取方式：多級(jí)逆流萃取,結(jié)晶,結(jié)晶方法：堿金屬