1、免疫組織化學(xué)技術(shù) Immunohistochemistry techniques,第一節(jié) 免疫組織化學(xué) 技術(shù)概述,（一）發(fā)展簡史,1941年Coons首先用熒光素標(biāo)記抗體檢測肺組織內(nèi)的肺炎雙球菌獲得成功。 60年代Nakane建立酶標(biāo)抗體技術(shù)運(yùn)用鐵蛋白標(biāo)記Ab技術(shù) 70 、80年代多位科學(xué)家改良上述技術(shù)，建立辣根過氧化物酶-抗過氧化物酶（PAP）技術(shù),抗生物素生物素（ABC）法使免疫組織化學(xué)進(jìn)入了應(yīng)用階段。,2000年以后各種免疫組化技術(shù)更加成熟,使免疫組化技術(shù)成為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)中形態(tài)、功能代謝綜合研究的一項(xiàng)有力工具。其應(yīng)用范圍深達(dá)醫(yī)學(xué)各個學(xué)科，是目前生命科學(xué)工作者應(yīng)該掌握的基本技術(shù)之一。,定義

2、:是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)。 將試劑抗原或試劑抗體用可以微量檢測的標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，在與標(biāo)本中的相應(yīng)抗體或抗原反應(yīng)后，可以不必測定抗原抗體復(fù)合物本身，而測定復(fù)合物中的標(biāo)記物，通過標(biāo)記物的放大作用，進(jìn)一步提高了免疫技術(shù)的敏感性。,（二）免疫組織化學(xué)的原理,抗原是指能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生（特異性）免疫應(yīng)答，并能

3、與免疫應(yīng)答產(chǎn)物抗體和致敏淋巴細(xì)胞在體內(nèi)外結(jié)合，發(fā)生免疫效應(yīng)（特異性反應(yīng)）的物質(zhì)?？乖幕咎匦杂袃煞N，一是誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力，也就是免疫原性，二是與免疫應(yīng)答的產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)，也就是抗原性,病原微生物 在醫(yī)療中將病原微生物制成疫苗進(jìn)行預(yù)防接種，可以提高人的免疫力。 嗜異性抗原 一類與種屬特異性無關(guān)的、存在于人以及某些動物、植物、微生物的性質(zhì)相同的抗原。 腫瘤抗原 由物理的、化學(xué)的因素或某些病毒誘發(fā)的實(shí)驗(yàn)動物腫瘤，其細(xì)胞中或細(xì)胞表面均出現(xiàn)特異性抗原，稱為腫瘤特異性抗原。已證實(shí)在某些人類腫瘤中心存在著與病毒密切相關(guān)的抗原。 同種異體抗原 動物免疫血清,與人類有關(guān)的抗原,抗體（antibody）指機(jī)體的

4、免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由B淋巴細(xì)胞或記憶細(xì)胞增殖分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。,世界著名抗體公司,Santa公司、Abcam公司、 Abgent公司、Proteintech Group、Cell Signaling Technology（CST）、 羅氏公司（Roche）,它借助于熒光素、酶等標(biāo)記抗體與組織切片或細(xì)胞涂片中相關(guān)抗原相結(jié)合，由于熒光素所發(fā)熒光可用熒光顯微鏡檢出，而酶可經(jīng)一定的顯色處理，呈現(xiàn)醒目的陽性色彩，從而可準(zhǔn)確定位欲測定的抗原物質(zhì)。,標(biāo)記物,熒光素、酶,標(biāo)記,抗 體,抗 原,熒光,陽性色彩,顯微鏡觀察,三大系統(tǒng) 本技術(shù)是應(yīng)用免疫學(xué)原理來識別待

5、測抗原，再通過酶和底物的作用外加顯色劑，將上述反應(yīng)顯示出來。,免疫組 織化學(xué),識別系統(tǒng),聯(lián)結(jié)系統(tǒng),顯示系統(tǒng),識別系統(tǒng)是指特異性抗體識別組織或細(xì)胞中的靶抗原?？乖贵w的特異性結(jié)合是本技術(shù)的基本依據(jù)。,聯(lián)結(jié)系統(tǒng)由聯(lián)結(jié)抗體構(gòu)成。它的作用是聯(lián)接識別系統(tǒng)和顯示系統(tǒng)。,顯示系統(tǒng)的目的是使抗原抗體間的特異性結(jié)合變?yōu)槿庋劭梢姟Ｒ虼孙@示系統(tǒng)由標(biāo)記酶，底物和顯色劑組成，以在靶抗原存在位點(diǎn)上形成有色沉淀。,特點(diǎn)： 特異性強(qiáng) 靈敏度高 定位準(zhǔn)確和簡便快速等優(yōu)點(diǎn) 又能夠?qū)⑿螒B(tài)、功能及代謝的研 究有機(jī)結(jié)合起來。,IHC方法,1 過去用過的方法ABC法，SP法。三步法，使用生物素 2 目前最常用的方法二步法： EnliVi

6、sion顯色系統(tǒng)（即用型非生物素免疫組化EnliVisionTM plus檢測試劑盒 ） 將多個抗鼠和抗兔的IgG分子二抗與辣根過氧化物酶通過一個多聚葡聚糖骨架聯(lián)接成一個大分子多聚體（polymer），直接放大信號40-50倍。 敏感、省時、方便、背景低（避免了內(nèi)源性生物素干擾）。,3 最新一代的免疫組化 Novolink Polymer法：使用小分子聚合物（減少細(xì)胞薄膜硬脂的阻礙，比傳統(tǒng)中的大分子聚合物染色更顯著），信號放大更強(qiáng)，還可以檢測到組織中低濃度的抗原。,IHC方法,EnliVision法的工作程序： 切片，烤片，脫蠟水化（使用防脫片處理的玻片：多聚賴氨酸，APES） H2O2處理（

7、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶），蒸餾水漂洗 組織切片的預(yù)處理（枸櫞酸鈉緩沖液中熱修復(fù)，酶消化暴露出抗原決定簇），TBS漂洗 內(nèi)源性過氧化物酶的阻斷 一抗孵育，TBS漂洗 二抗孵育，TBS漂洗 DAB顯色，蒸餾水中止反應(yīng) 蘇木素復(fù)染及封片,IHC技術(shù)的基本操作流程,切片,烤片,脫蠟水化,H2O2處理,熱修復(fù),一抗,二抗Enlivision試劑,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,IHC染色結(jié)果的判讀原則,玻片干燥造成的“邊緣效應(yīng)”,假 陽 性,未阻止內(nèi)源性過氧化物酶,阻止內(nèi)源性過氧化物酶后,I. 注意影響IHC結(jié)果判讀的因素,酒精固定,福爾馬林固定,胰腺，insulin,平滑肌肉瘤，SMA,氣泡影響抗體抗體反應(yīng),假

8、陰性：注意內(nèi)對照,假 陰 性,蛋白酶處理后,蛋白酶未處理,皮膚，IV膠原,甲狀旁腺，PTH,微波未處理,微波處理后,II. 染色的特異性判定,Fujita Health University School of Medicine,Mitochondoria,Apical membrane,Basolateral membrane,Plasma Membrane + PERGolgi,Plasma membrane,PER + Golgi,Golgi apparatus,Endocrine granule,Endocrine granule Lysosome,Cytosol,Nucleus,Cy

9、toskeleton,amylase lysozome PAcP,S-100 NSE prefixation diffusion artifact,CEA EMA ALP CD10,cytochrome P-450,immunogloblin AFP HCG factor -RA prolactin in activated pituicyte,SC EGFR E-cad,Leu 4 HLA-DR CEA, EMA, SC, CA19-9 in cancer cell,Leu 1 LCA PALP in seminoma cell Cerb-B2,SC, AFP EMA, immunoglob

10、ulin in special conditions,chromogranin A serotonin Peptide hormone,DNA polymerase S-100 (occasional) estrogen receptor,keratin in carcinoid, mesothelioma vimentin,keratin in adenocarcinoma hepatocyte actin,keratin vimentin GFAP tubulin,各抗原在細(xì)胞內(nèi)的顯色方式,細(xì)胞膜陽性,細(xì)胞粘附分子： E-cadherin、CD31、CD56等 交聯(lián)膜蛋白分子：cateni

11、n、dystrophin 等 細(xì)胞表面受體：EGFR、c-erbB2、c-kit/CD117（酪氨酸激酶受體）等 絕大多數(shù)白細(xì)胞抗原: LCA、CD20、CD2、CD5等 表面或跨膜蛋白：Villin、BerEP4、EMA、 CEA、CA125、EBV-LMP1等,細(xì)胞核陽性,細(xì)胞周期素蛋白：cyclins、cyclin 依賴激酶(cdk)、cdk 抑制劑 (如 p16)等 細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白：Ki67、PCNA 轉(zhuǎn)錄因子：MyoD1、myogenin、TTF-1、CDX2、PAX5 腫瘤抑制基因：如 p53、p63、Rb、WT1 基因錯配產(chǎn)物：如 MLH1、MSH2,細(xì)胞核酶：如 TdT 類固

12、醇激素受體：如 ER、PR、AR 細(xì)胞核鈣結(jié)合蛋白：如 S100蛋白、calretinin 定位細(xì)胞核的病毒：如 CMV、HBcAg（核+核周） NeuN：neuronal nuclei，表達(dá)于成熟的神經(jīng)元,細(xì)胞漿內(nèi)顆粒狀陽性-定位于細(xì)胞器,溶酶體顆粒：如 lysozyme、CD68、myeloperoxidase 黑色素小體和前黑色素小體：如 HMB45、Melan-A 細(xì)胞毒顆粒：如TIA-1、granzyme B 線粒體: 如抗線粒體抗體, HEP-PAR1 神經(jīng)內(nèi)分泌顆粒：各種激素（如PTH、 ACTH、insulin）、CgA、Syn W-P 小體: F-VIII相關(guān)抗原 分泌顆粒：

13、如BRST-2、surfactant、PSA 細(xì)胞內(nèi)微生物：如弓形蟲,細(xì)胞漿纖維狀陽性-中間絲或微絲,中間絲;CK;Vimentin;Desmin GFAP（glial fibrillary acidic protein，膠質(zhì)纖維酸性蛋白 ） NF（Neurofilament，神經(jīng)元胞漿節(jié)細(xì)胞神經(jīng)瘤，副節(jié)瘤/嗜鉻細(xì)胞瘤，神經(jīng)母細(xì)胞瘤） Nestin：巢蛋白，神經(jīng)前體細(xì)胞,彌漫或片狀的細(xì)胞漿陽性,蛋白分布在細(xì)胞內(nèi)液、大量的微囊及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中 如:myoglobin、hemoglobin、albumin、AFP、 NSE、cytoplasmic Ig、CD3 病毒顆粒/蛋白 如:HBsAg（常在核旁著

14、色） 從細(xì)胞間液吸收的蛋白 如: Ig、 albumin, 分化差惡性腫瘤的診斷和鑒別診斷； 證實(shí)內(nèi)分泌腫瘤和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤； 應(yīng)用腫瘤胚胎性抗原診斷某些腫瘤，如癌胚抗原（CEA）對胃腸道癌、甲胎蛋白（AFP）對肝癌和卵巢內(nèi)胚竇癌診斷有幫助；,（三）免疫組化的應(yīng)用, 有時可幫助確定腫瘤的良惡性，如應(yīng)用免疫球蛋白輕鏈和來鑒別濾泡性惡性淋巴瘤和濾泡性反應(yīng)性增生； 研究某些癌癥與病毒的關(guān)系，如肝癌與乙型肝炎病毒、鼻咽癌與EB病毒、宮頸癌與乳頭狀瘤病毒等的關(guān)系；, 為腫瘤治療的選擇提供依據(jù)，如乳腺癌檢測雌、孕激素受體（ER、PR）呈陽性時，應(yīng)用他莫昔芬（三苯氧胺）治療可預(yù)期獲得較好的療效； 檢測癌基因

15、和抑癌基因蛋白產(chǎn)物（如c-erbB2，p53）、增生活性抗原（如Ki-67，PCNA）用來估計腫瘤的預(yù)后。,免疫組化在臨床診斷中 應(yīng)用病例示范（Case 1）,臨床病史資料：48歲，男性，胃活檢標(biāo)本取自胃大彎部位。H 浸蠟及包埋過程中,石蠟溫度應(yīng)保持在60或60以下,用熔點(diǎn)低的石蠟包埋; 制備蠟塊在較低的溫度進(jìn)行,故試劑處理時應(yīng)適當(dāng)延長,否則會給切片帶來困難,常用的包埋法,石蠟包埋 冰凍干燥包埋 塑料包埋,（四）組織切片中載玻片的處理,抗原修復(fù)過程中，由于高溫、高壓、輻射 等諸多因素的影響，極易造成脫片。為保證 試驗(yàn)的正常進(jìn)行，可選用Poly-L-Lysine 、 ZLI-9001 APESZ

16、LI-9003 HistogripTM或 ZLI-9005 等幾種試劑，對已常規(guī)清洗的載 玻片進(jìn)行處理。具體方法如下：,Poly-L-Lysine：將洗凈、干燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中，浸泡5分鐘，60oC烤箱烘烤一小時或室溫過夜干燥。裝盒備用。試驗(yàn)中使用的器具均為非玻璃制品。,（五）抗原修復(fù),抗原修復(fù)是指石蠟、冰凍、火棉膠、塑料切片免疫組織化學(xué)（IHC）前用胰蛋白酶、尿素、表面活性劑、微波緩沖液和金屬鹽等，使被掩蓋的抗原決定簇或變性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢復(fù)過程。,石蠟切片為什么要做抗原修復(fù)？有那些方法？,石蠟切片標(biāo)本均用甲醛固定，使得細(xì)胞內(nèi) 抗

17、原形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決 定簇,同時蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇 隱蔽.所以要求在進(jìn)行IHC染色時,需要先進(jìn)行 抗原修復(fù)或暴露,即將固定時分子之間所形成 的交聯(lián)破壞，而恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài)。,常用的抗原修復(fù)方法有微波修復(fù)法，高壓加熱法，酶消化法，水煮加熱法等，常用的修復(fù)液是pH6.0的0.01mol/L的檸檬酸鹽緩沖液。,抗原修復(fù)方法,一、熱修復(fù) 1、微波爐加熱法 將玻片分別插入抗原修復(fù)盒中，以保證各部位的玻片受熱均勻。 在抗原修復(fù)盒中加入抗原修復(fù)液，蓋上帶有小孔的蓋子。 將塑料盒置于微波爐中央，加熱 2x5min 。兩次加熱之間，加入 50ml 蒸餾水。 加熱過程中，組織標(biāo)

18、本不可干燥。,在壓力鍋中放入 1500-3000ml 抗原修復(fù)緩沖液加熱到沸騰，不加閥，玻片插入切片架并放入沸騰的修復(fù)緩沖液中。后加閥，使之加壓2分鐘。后將壓力鍋置于流水槽或繼續(xù)冷卻 20 分鐘（減壓）。取出切片，蒸餾水沖洗，移至 TBS 或 PBS 液中，以避免組織干燥。 以下同微波爐修復(fù)法 。,2、壓力鍋法,抗原修復(fù)的方法選擇，關(guān)系到組織抗原能否暴露充分，這對免疫組化染色效果有很大影響。因此應(yīng)當(dāng)根據(jù)不同的抗原特點(diǎn)，采用不同的修復(fù)方法。對某些細(xì)胞內(nèi)抗原（如Fas、Bax、F等）和細(xì)胞間質(zhì)抗原（如Laminin、CoIV等）則需要用酶消化法處理切片。,二、酶消化方法,1、胰蛋白酶處理： A 滴

19、加一滴胰蛋白酶工作液于組織上。 B 室溫 37 孵育 20-40 分鐘，孵育時間的長短依福爾馬林固定時間及所測抗原情況而定。 C 蒸餾水沖洗，終止反應(yīng)。 D 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。 E 免疫組化染色。,2、胃蛋白酶處理 A 滴加胃蛋白酶工作液于組織上。 B 最佳消化時間取決于福爾馬林的固定時間， 37 預(yù)熱。一般消化 10 分鐘，長至 30 分鐘。 C 以下同胰蛋白酶處理方法 3 ,4,5 。 注：過度消化將導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)的丟失，并引起組織脫片,三、綜合方法,微波爐加胰酶修復(fù)法： 將組織切片置于盛有 50ml 修復(fù)液的塑料盒中，封口膜封口后加熱 5 分鐘。 冷卻后打開，將切片置于 37 預(yù)熱的蒸

20、餾水中，胰蛋白酶消化。 室溫胰蛋白酶處理 30 秒鐘。 蒸餾水沖洗。 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，置蒸餾水中。 免疫組化染色。,操作中還應(yīng)注意如下問題：,1、熱處理后應(yīng)注意自然冷卻。2、熱處理時要防止切片干燥。3、應(yīng)根據(jù)不同的抗體選擇合適的抗原修復(fù)方法。4、一批抗原的檢測其溫度和時間一定保持一致。,5、注意形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的改變(一般經(jīng)高溫修復(fù)后胞漿會無明顯的破壞，而對細(xì)胞核的影響較大，會出現(xiàn)核破裂，蘇木素淡染等現(xiàn)象，而經(jīng)酶水解的切片，其細(xì)胞漿破壞視消化時間而異，但核破壞較輕)。6、如果在常用的緩沖液中無法實(shí)現(xiàn)抗原修復(fù)，或經(jīng)修復(fù)后抗原定位發(fā)生改變，可改用一些不常用的緩沖液，或加一些螯合劑，如EDTA等可改善某些抗原的修復(fù)。,免疫組化操作經(jīng)驗(yàn)和體會,操作中應(yīng)注意以下問題： 1.石蠟切片和冰凍切片均可，但要注意防止脫片。 2.消除內(nèi)源性過氧化酶和非特意性背景染色要充分。 3.PBS洗滌要充分。 4.要設(shè)陰性和陽性對照。