1、紫外-可見分光光度法在藥品檢驗中的應(yīng)用,1,2,3,4,分光光度法的基本原理,紫外分光光度計,紫外可見分光光度法在藥檢中應(yīng)用,content,概述,一.概述：,分光光度法是通過測定物質(zhì)在某些特定波長處或一定范圍內(nèi)的吸光度或發(fā)光強度，對物質(zhì)進(jìn)行定性和定量的分析方法。紫外-可見分光光度法具有操作簡便快速、專屬性和靈敏度高等優(yōu)點。因此在藥品的分析檢驗中被廣泛采用。在各國藥典中藥品的理化常數(shù)、鑒別、檢查和含量測定等各個項目中都能見到紫外-可見分光光度法的應(yīng)用實例。,一.概述：,吸收光譜：發(fā)射連續(xù)光譜的光源（如氘燈和鎢絲燈）發(fā)出的光通過透明物質(zhì)（固體、液體或氣體）后，一些波長的單色光成分被該物質(zhì)選擇吸收

2、，在原來的連續(xù)光譜上出現(xiàn)若干條暗線或暗帶，這種光譜叫做吸收光譜。,1,2,3,4,分光光度法的基本原理,紫外分光光度計,紫外可見分光光度法在藥檢中應(yīng)用,content,概述,二.分光光度法的基本原理,在紫外和可見光區(qū)，靈敏度和精密度較高，一般每1ml溶液中含有幾微克（g）的物質(zhì)即可測定，誤差約為1-2%，在此區(qū)域內(nèi)，物質(zhì)對光的吸收主要系分子中電子的能級躍遷所致，同時伴有分子的振動和轉(zhuǎn)動能級的變化，電子吸收光譜一般比較平緩，選擇性不如紅外光區(qū)，故紫外-可見光區(qū)主要用于定量分析以及作為物理常數(shù)的測定。,紅外光區(qū)的靈敏度和精密度較低，一般需要數(shù)百微克（g）的供試品進(jìn)行測定，此區(qū)域內(nèi)，物質(zhì)對光的吸收系

3、由分子中振動和轉(zhuǎn)動能級的躍遷引起，紅外光譜的特征性很強，特別是在7-15m（稱為“指紋區(qū)”），吸收峰很多，而且尖銳。除光學(xué)異構(gòu)體外，不會遇到兩種不同的化學(xué)物質(zhì)完全相同的紅外吸收光譜，故紅外區(qū)主要用于鑒別和分析物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。,透光率（T）：單色光通過一物質(zhì)的溶液時，透過光的強度（I）與入射光的強度（I0）之比。即：T=I/I0。 吸光度（A）：透光率的負(fù)對數(shù)值.即:A=log1/T= -logT 比耳-郎伯定律（Beer -Lamberts Law）：吸光度（A）與溶液的濃度（C）和光路長（L）是成正比例的。即：A=ECL,比耳-郎伯定律適用范圍： 1.溶液的濃度不能過高或過低，使測定結(jié)果的相對誤

4、差最小的最佳透射率為T=37%左右。 2.所用溶劑不得與測定物質(zhì)有分子間締合，生成復(fù)合物、異構(gòu)化或出現(xiàn)酸堿平衡。,1,2,3,4,分光光度法的基本原理,紫外分光光度計的使用,紫外可見分光光度法在藥檢中應(yīng)用,content,概述,三.紫外-可見分光光度計的使用,1.基本構(gòu)造：,穩(wěn)壓電源,光源,波長選擇裝置,樣品池,檢 測 器,記錄裝置,2.儀器的校正和檢定,（1）波長的校正：由于溫度變化對機械部分的影響，儀器的波長經(jīng)常會略有變動，因此除應(yīng)定期對所用儀器進(jìn)行全面校正檢定外，還應(yīng)于測定前校正測定波長。 鈥玻璃在279.4nm、287.5nm、333.7nm、 360.9nm、418.5nm、460.

5、0nm、484.5nm、 536.2nm與637.5nm的波長處有尖銳的吸收 峰，可作為波長校正用。,取在120C干燥至恒重的基準(zhǔn)重鉻酸鉀約 60mg，精密稱定，用0.005mol/L硫酸溶液溶解 并稀釋至1000ml，在規(guī)定的波長處測定吸光度 并計算其吸收系數(shù)。,（2）吸光度的準(zhǔn)確度：,（3）雜散光的檢查： 按下表的試劑和濃度，配制成水溶液，置1cm石英吸收池中，在規(guī)定的波長處測定透光率，應(yīng)符合表中的規(guī)定。,3.紫外分光光度法對溶劑的要求,用1cm石英吸收池盛溶劑，以空氣為空白，測 定其吸光度，溶劑和吸收池的吸光度應(yīng)滿足以下 要求： 波長 吸光度要求 220nm-240nm不得超過0.40

6、241nm-250nm不得超過0.20 251nm-300nm不得超過0.10 300nm以上 不得超過0.05,4.紫外分光光度法測定法,測定時，除另有規(guī)定外，應(yīng)以配制供試品溶液的同批溶劑為空白對照，采用1cm的石英吸收池，在規(guī)定的吸收峰波長2nm以內(nèi)測試幾個點的吸光度，以核對供試品的吸收峰波長是否準(zhǔn)確。 應(yīng)以吸光度最大的波長作為測定波長。 儀器的狹縫波帶寬度應(yīng)小于供試品吸收帶的半寬度，否則測得的吸光度會偏低。狹縫寬度的選擇，應(yīng)以減小狹縫寬度時供試品的吸光度不再增加為準(zhǔn)。 由于吸收池和溶劑本身可能有空白吸收，因此測定供試品的吸光度后應(yīng)減去空白讀數(shù)，再計算含量。,1,2,3,4,分光光度法的基

7、本原理,紫外分光光度計的使用,紫外可見分光光度法在藥檢中應(yīng)用,content,概述,四.紫外-可見分光光度法在藥品檢驗中的應(yīng)用,藥典和藥品標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)用紫外-可見分光光度法的項目有吸收系數(shù)、鑒別、顏色檢查、純度檢查、溶出度、含量均勻度檢查和含量測定等等。,1.吸收系數(shù)：,藥品的吸收系數(shù)是藥品的理化特性常數(shù)，可作為藥品生產(chǎn)過程中精制純化的一種指標(biāo)。對紫外區(qū)一定波長的光有特征吸收的藥物進(jìn)行精制時，應(yīng)進(jìn)行到產(chǎn)品在其特定波長測定吸收系數(shù)達(dá)到一個穩(wěn)定的最大值時為止，因此吸收系數(shù)同其它物理常數(shù)一樣，也可作為判斷藥品純度的依據(jù)。,2.鑒別：,藥物對光輻射的吸收特點（即其吸收光譜）可與其它化學(xué)的或物理的方法配合作

8、為鑒別的一種手段，即繪制出藥物的吸收光譜曲線與標(biāo)準(zhǔn)品的吸收光譜互相核對。 對于具有兩個以上最大吸收的藥物可以進(jìn)一步簡化操作，無需費時作吸收光譜曲線，只要測出各最大吸收波長處的吸收度，求出這些吸收度的比值，測出它們相對位置的比值即可。,維生素B12的鑒別規(guī)定每1ml中含維生素B1225g的水溶液，照分光光度法測定，在278、361與550nm的波長處有最大吸收。 A361nm/A278nm應(yīng)為1.70-1.88。 A361nm/A550nm應(yīng)為3.15-3.45。,3.純度檢查：,若一種化合物對紫外光和可見光區(qū)的某一波段呈光學(xué)透明（即不吸收或幾乎不吸收），而不純雜質(zhì)有吸收時，則該物質(zhì)的生產(chǎn)精制應(yīng)

9、當(dāng)進(jìn)行到規(guī)定波長處的吸收系數(shù)降到最低時為止。有些藥物就以此作為雜質(zhì)限度檢查的依據(jù)。此外，有些藥物的雜質(zhì)是通過比色法與雜質(zhì)對照品比較進(jìn)行控制的。,檢查腎上腺素中的酮體：取腎上腺素，加0.1mol/L鹽酸溶液，制成每1ml中含2mg的溶液，照分光光度法，在310nm的波長處測定，吸光度不得過0.05。,4.含量測定：,藥典中含量測定方法可分為： （1）對照品比較法 （2）吸收系數(shù)法 （3）比色法,（1）對照品比較法：,應(yīng)用范圍： 單一成分藥劑的測定。 混合物或復(fù)方制劑，但其它成分在被測組分的測定波長沒有或幾乎沒有吸收,測定要求 分別配制供試品溶液和對照品溶液 對照品溶液所含對照品的量應(yīng)為供試品溶液

10、中被測組分標(biāo)示量的10%以內(nèi)。 所用溶劑、其它試劑、操作方法和條件都應(yīng)保持一致。,計算公式： Cs=Cr*As/Ar Cs：供試品溶液的濃度 As：供試品溶液的吸光度 Cr：對照品溶液的濃度 Ar：對照品溶液的吸光度,（2）吸收系數(shù)法：,應(yīng)用范圍： 單一成分藥劑的測定。 混合物或復(fù)方制劑，但其它成分在被測組分的測定波長沒有或幾乎沒有吸收,測定要求： 通常為測定最大吸收峰波長處的吸光度 供試品溶液在測定波長處濃度與吸光度嚴(yán)格遵循比耳-郎伯定律，具有良好的線性關(guān)系。 測定條件和操作應(yīng)與測定吸收系數(shù)時完全一致。 吸收系數(shù)是用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別在經(jīng)過校正的不同型號分光光度計上進(jìn)行多次測定求得的平均值。 特別

11、注意儀器的校正和檢定,計算公式： A=ECL 以中國藥典2000年版氯霉素含量測定為例: 精密稱取氯霉素0.1009g，置100ml量瓶中， 加乙醇10ml振搖使溶解，加水稀釋至刻度，搖勻， 精密量取2ml，置100ml量瓶中，加水稀釋至刻 度，在278nm波長處測定吸光度為0.596，按氯 霉素(C11H12Cl2N2O5)吸收系數(shù)(E1%1cm)為298計 算氯霉素含量。 已知：A=0.596 E=298 L=1 則： C=A/(E*L)=0.596/(298*1)%=0.002% 氯霉素含量 =0.002%*100*100/(0.1009*2)=99.1%,（3）比色法,供試品本身在紫外可見光區(qū)沒有強吸收，或在紫外區(qū)雖有吸收，但為了避免干擾或提高靈敏度，可加入適當(dāng)?shù)娘@色劑顯色后測定,鹽酸可樂定片及注射液：