1、組長(zhǎng)許田博士（中） 和吳曉暉博士（右） 與丁昇同學(xué),PiggyBac（PB）轉(zhuǎn)座子,是一個(gè)自主因子，長(zhǎng)2 476 bp，,國(guó)際頂級(jí)生命科學(xué)雜志cell發(fā)表 /future,有的基因不是固定在染色體的一個(gè)位置上， 是可以移動(dòng)的，稱為可動(dòng)基因或轉(zhuǎn)座元件。,3.6 轉(zhuǎn)座元件,易位(translocation)： 是染色體的一部分因斷裂脫離，并與其它染色體聯(lián)結(jié)的重排過程。,轉(zhuǎn)座（transposition）： 在轉(zhuǎn)座酶的作用下，轉(zhuǎn)座因子或是直接從原來的位置上切離下來插入染色體的新的位置，或者是染色體上的DNA序列轉(zhuǎn)錄成RNA，RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA插入染色體上新的位置。,Ac-Ds系統(tǒng) 插入序列 轉(zhuǎn)座

2、子 P因子和 FB因子 反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子,以DNA為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)座因子。 自主的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座因子，如：病毒超家族的各成員。 非自主的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座因子 。如：細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)錄物,轉(zhuǎn)座元件的分類：,Ac-Ds系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)：,1932年McClintock 發(fā)現(xiàn)了 玉米籽粒色素斑點(diǎn)不穩(wěn)定 遺傳行為。 1951年首次提出可在染色 體上移動(dòng)的控制元件的概 念。 1984年獲得諾貝爾獎(jiǎng)。,Ac-Ds系統(tǒng),McClintock (1902-1992 ),位于玉米的第9 染色體 C 基因，色素合成基因。 Ac 基因，自主移動(dòng)的調(diào)節(jié)因子。4.5 kb, 5 個(gè)exon,兩端有11bp的IR, 編碼轉(zhuǎn)座酶。 Ds 基因，不能自

3、主移動(dòng)。 0.5-4.0 kb, 兩端也有11bp的IR, 插入位點(diǎn)有正向重復(fù)序列。插入引起色素不能合成。,關(guān)于Ac-Ds 系統(tǒng),每個(gè)控制元件家族都含有自主成員和非 自主成員，自主成分可以轉(zhuǎn)座，非自主成分不能獨(dú)立轉(zhuǎn)座。,C基因的突變和回復(fù)突變,野生型C基因使胚乳 呈紫色，C基因的突 變那么胚乳呈白色。 McClintock推測(cè)：C 突變是由解離因子 （Ds）插入到C基因引 起的。另一個(gè)可移動(dòng) 的控制因子是激活因 子（Ac），它可激活 Ds轉(zhuǎn)座進(jìn)入C基因， 也能使Ds從基因中轉(zhuǎn) 出，使突變基因產(chǎn)生 “回復(fù)突變”，從而出 現(xiàn)斑點(diǎn)。,插入序列 (insertion sequence, IS),插入序

4、列是最簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)座子,長(zhǎng)度多在7001500bp左右。 由末端反向重復(fù)序列(IR)，轉(zhuǎn)座酶基因組成。插入基因組中時(shí)，在靶位上生成正向重復(fù)序列(DR),插入序列 IS的遺傳學(xué)特性：,能編碼轉(zhuǎn)座酶，自主進(jìn)行轉(zhuǎn)座。 插入位點(diǎn)是隨機(jī)的。 插入后是宿主染色體的插入位置上產(chǎn)生短的正向重復(fù)序列。 轉(zhuǎn)座是罕見事件。 插入片斷精確切離后，可使IS誘發(fā)的突變回復(fù)為野生型。 不精確切離使插入位點(diǎn)附近的宿主基因發(fā)生缺失。,轉(zhuǎn)座子插入處正向重復(fù)序列的產(chǎn)生,轉(zhuǎn)座子（transposon,Tn）,帶有轉(zhuǎn)座酶基因等必需基因,和抗藥性等與轉(zhuǎn)座無關(guān)基因的轉(zhuǎn)座因子。 結(jié)構(gòu)特征： 兩端具有同向或反向插入序列，同時(shí)，兩端的IS可能相同或

5、不同。,兩個(gè)IS10組件構(gòu)成一個(gè)復(fù)合轉(zhuǎn)座子，它能使DNA的位于他們之間的任何部位活動(dòng)。當(dāng)Tn10是一個(gè)小的圓形分子的一部分時(shí)，IS10重復(fù)序列可轉(zhuǎn)座環(huán)狀分子的任一側(cè)。,轉(zhuǎn)座因子的轉(zhuǎn)座途徑：,復(fù)制轉(zhuǎn)座,非復(fù)制轉(zhuǎn)座,復(fù)制轉(zhuǎn)座作用引起了轉(zhuǎn)座子的一個(gè)復(fù)制，它插入到一個(gè)接受位點(diǎn)。捐贈(zèng)位點(diǎn)保持不變，以致捐贈(zèng)者和接受者都有轉(zhuǎn)座子的一個(gè)復(fù)制。,復(fù) 制 轉(zhuǎn) 座,復(fù)制性轉(zhuǎn)座要經(jīng)過一個(gè)共整合階段,復(fù)制性轉(zhuǎn)座的原則是，轉(zhuǎn)座子通過復(fù)制自身而轉(zhuǎn)座，在供體和受體位點(diǎn)均有一個(gè)拷貝. 整個(gè)過程中需要解離酶和轉(zhuǎn)座酶。,供體,受體,接合是由一種類型細(xì)胞分泌的信息素與另一種 類型細(xì)胞攜帶的受體相互作用開始的。 型細(xì)胞分泌多肽因子（含

6、有13 個(gè)氨基酸）。 a型細(xì)胞分泌a因子（含有12個(gè)氨基酸）。 接合型a 是由位于MAT 基因座的基因信息決定 的。帶有MATa 等位基因的細(xì)胞為a類型。 a/型細(xì)胞攜帶有MATa 基因和MAT基因，能 夠產(chǎn)生孢子。 雜合子能產(chǎn)生孢子，純合子不能產(chǎn)生孢子。,酵母接合型：,類型相反的細(xì)胞能夠接合； 同型的則不能接合。,酵母接合型的相互轉(zhuǎn)換是復(fù)制轉(zhuǎn)座所產(chǎn)生。,非復(fù)制機(jī)制轉(zhuǎn)座：轉(zhuǎn)座因子做物理性運(yùn)動(dòng)，直接從一個(gè)位點(diǎn)到另一個(gè)位點(diǎn)，并且是保守的，有如下兩種機(jī)制。,非復(fù)制轉(zhuǎn)座作用允許一個(gè)轉(zhuǎn)座子像物體一樣從捐贈(zèng)們點(diǎn)移動(dòng)到接受位點(diǎn)，這樣就在捐贈(zèng)位點(diǎn)留下了一個(gè)斷裂，這就是致死因子，除非它能被修理。,保守性轉(zhuǎn)座只是

7、序列的直接移動(dòng)，沒有核苷酸鍵的損失，原位點(diǎn)沒有鏈斷裂。,非復(fù)制性轉(zhuǎn)座要經(jīng)過鏈的斷裂與重連,當(dāng)交換結(jié)構(gòu)被切斷后釋放出來時(shí)發(fā)生非復(fù)制性轉(zhuǎn)座，將轉(zhuǎn)座子插入靶DNA，兩翼為正向重復(fù)序列，供體位點(diǎn)則留下斷裂的雙鏈。,Donor DNA （ green ）,transposase (blue spheres),target DNA (red).,the mechanism of transposition（cut and paste）,P因子和 FB因子,P因子（P element）：所有的突變都是由于W 位點(diǎn)插入了DNA片段。這個(gè)插入順序被稱 為P因子。,P因子 果蠅中存在的轉(zhuǎn)座元件 FB 家族 cop

8、ia 反轉(zhuǎn)座子,果蠅分成為I（inducer）型雄果蠅和R（reactive）型雌果蠅雜交看來會(huì)降低生育力，但反交并不如此。 果蠅分成為P型（父本貢獻(xiàn)的，paternal contributing）和M型（母本貢獻(xiàn)的，matenal contributing）。,在果蠅中已鑒別出兩個(gè)系統(tǒng)與雜種不育有關(guān),開放閱讀框 4個(gè), 2.9kb 內(nèi)含子 3個(gè) P因子表達(dá)差異： ORF 0, 1, 2 66 KD ， 轉(zhuǎn)座阻遏物 ORF 0 ,1 ,2 ,3 87KD ， 轉(zhuǎn)座酶 P 型細(xì)胞質(zhì)：含66 KD ， 阻遏轉(zhuǎn)座,P因子,66KD蛋白質(zhì)是卵中母體因子產(chǎn)生的,具有抑制轉(zhuǎn)座的能力。 含有P因子的雌果蠅與

9、雄果蠅雜交，由于P細(xì)胞型(66KD的蛋白質(zhì))的存在抑制了轉(zhuǎn)座酶的合成或激活。 雌果蠅為M型時(shí)，在卵中無阻遏物，則導(dǎo)致來自雄果蠅中的P因子使生殖細(xì)胞中轉(zhuǎn)座酶活化。,FB 因 子,FB(Foldback 的縮寫)，具有不同長(zhǎng)度 的末端重復(fù)序列。有些FB 元件包含很 多并排的插入重復(fù)序列，但另一些FB 中插入重復(fù)序列被非重復(fù)序列所分隔。 FB 元件的末端結(jié)構(gòu)很令人迷惑，有時(shí) 兩個(gè)不相同的FB 能協(xié)同轉(zhuǎn)座一段DNA 插入片段。,果蠅中的FB因子的長(zhǎng)度和DNA 序列 有很大的變化，能引起不穩(wěn)定的突變，造成染色體的缺失和重排。 FB兩端有很長(zhǎng)的反向重復(fù)序列，二者或者是直接相鄰，或者中間隔開幾個(gè)kb。當(dāng)這些

10、序列變性時(shí)，很容易反折成為發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)。,反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子,通過RNA為中介，反轉(zhuǎn)錄成DNA后進(jìn)行轉(zhuǎn)座 的可動(dòng)元件，分為兩類。 反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座作用是新基因形成和基因組復(fù)雜 性提高的主要因素。,病毒超家族,可編碼反轉(zhuǎn)錄酶或整合酶，自主轉(zhuǎn)錄。呈DNA時(shí)，具有LTR序列。 非病毒超家族,不可編碼反轉(zhuǎn)錄酶或整和酶，不能自主轉(zhuǎn)錄。呈DNA時(shí)，無LTR序列。,反轉(zhuǎn)錄病毒,原病毒(Provirus) 被整合到細(xì)胞基因組中的逆轉(zhuǎn)錄病毒序列。 逆轉(zhuǎn)錄酶(Reverse transcriptase) 負(fù)責(zé)將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成DNA 的酶。 前病毒DNA（Provirus DNA ） 這種插入的、經(jīng)反轉(zhuǎn)錄生成的DNA 。 內(nèi)源

11、性前病毒 下一代細(xì)胞即使未經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄病毒直接感染， 在基因組中也帶有了前病毒DNA。,病毒的RNA基因組經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成為雙鏈DNA，雙鏈DNA 插入宿主的基因組中。已整合的DNA再轉(zhuǎn)錄出病毒RNA。,反轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期,反轉(zhuǎn)錄病毒的表達(dá)產(chǎn)物為多聚蛋白， 經(jīng)過加工后才成為單個(gè)蛋白。,gag 編碼病毒的核心蛋白 pol 編碼反轉(zhuǎn)錄酶 env編碼病毒的薄膜蛋白,LTR是如何轉(zhuǎn)錄而成的呢？,1. RNA正鏈,4. DNA負(fù)鏈合成中止,2. 退火,3. DNA負(fù)鏈合成,7. 反轉(zhuǎn)錄酶繼續(xù)作用,6. 第一次跳躍,5. RNA鏈在5端降解,8. RNA引物被除掉,13. 負(fù)鏈DNA合成， LTR生成,12.

12、正鏈DNA合成,11. 第二次跳躍,10. 合成中止的DNA鏈,9. RNA降解，DNA合成,LTR對(duì)病毒DNA整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組合控制病毒 RNA合成有著重要的作用。 LTR在U3區(qū)內(nèi)有同“TATAA”框相似的序列。TATTA 框是真核生物中使用RNA多聚酶的轉(zhuǎn)錄單位所特有 的序列。 每個(gè)LTR的U3帶有一個(gè)啟動(dòng)子。左邊LTR中的啟動(dòng)子 負(fù)責(zé)起始前病毒的轉(zhuǎn)錄。 LTR中有增強(qiáng)子序列，可增強(qiáng)病毒RNA的轉(zhuǎn)錄能力， 或?qū)η安《綝NA兩側(cè)宿主DNA的轉(zhuǎn)錄活性起調(diào)控作用。,LTR的功能：,酵母Ty（Transposon yeast）轉(zhuǎn)座元件,Ty的轉(zhuǎn)座效率比細(xì)菌轉(zhuǎn)座子要低，在 Ty插入位點(diǎn)兩側(cè)各生

13、成5bp的重復(fù)序列。 Ty的結(jié)構(gòu)基因基本相同，長(zhǎng)約6.3kb,兩端 有330bp的正向重復(fù)序列，稱為序列。,Ty 組分的兩端是短的正向重復(fù)序列。Ty組分轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生兩個(gè)具有重疊序列的轉(zhuǎn)錄本，TyA是結(jié)合蛋白，TyB含有反轉(zhuǎn)錄酶，蛋白酶和整合酶的同源物。,人為構(gòu)造 獨(dú)特Ty 組分 內(nèi)含有一個(gè) 內(nèi)含子。 轉(zhuǎn)座拷貝具有相 同的末端重復(fù)， 內(nèi)含子被刪除。 Ty 通過RNA 剪接 除去內(nèi)含子，反 轉(zhuǎn)錄成DNA，插 入染色體的新位 置。,果蠅中三種類型的轉(zhuǎn)座成分具有不同的結(jié)構(gòu),copia 反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子,copia的拷貝數(shù)是由果蠅的種系決定的，通常是 20-60 個(gè)拷貝。家族的成員非常分散，在每一種 果蠅中c

14、opia的位點(diǎn)都表現(xiàn)出很大的不同。 copia 元件長(zhǎng)大約5000bp，有相同的276bp 同向 重復(fù)序列。在插入位點(diǎn)使靶基因產(chǎn)生5bp 同向重 復(fù)。 copia 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是一系列poly(A)+mRNA， 包括全長(zhǎng)的和部分長(zhǎng)度的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。這些mRNA 有相同的5端。,哺乳動(dòng)物基因組含很多相對(duì)短但彼此相關(guān)的序列， 其重要部分包含轉(zhuǎn)座子。可歸納為兩個(gè)家族。,LINES L1重復(fù)序列和SINES,非自主反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子,長(zhǎng)散布重復(fù)序列(LINES)： RNA 聚合酶的轉(zhuǎn)錄物 短散布重復(fù)序列(SINES)： RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄物,LINE L1沒有LTR,故歸于非病毒超家族。但測(cè)序發(fā)現(xiàn)LINE L

15、1的一個(gè)可讀框同反轉(zhuǎn)錄酶是同源的 被歸入病毒超家族。 L1被認(rèn)為是人類基因組中主要的可動(dòng)因子，除能自主轉(zhuǎn)座外，它的蛋白質(zhì)產(chǎn)物可促使非自主轉(zhuǎn)座因子的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座。 L1還能十分有效地將位于L1 3端的側(cè)序一起轉(zhuǎn)座到新的位置，這種作用稱為3轉(zhuǎn)導(dǎo)，將宿主基因組中的原先不連鎖的兩個(gè)DNA片段排列在一起。,LINE L1,LINES 元件無LTR，其逆轉(zhuǎn)錄是怎樣進(jìn)行的？,反轉(zhuǎn)座子編碼的核酸內(nèi)切酶活性將靶基因位點(diǎn)切口。 相關(guān)RNA 產(chǎn)物結(jié)合到切口上。切口提供一個(gè)3-OH 末端， 以此為引物，以RNA 為模板合成cDNA。 然后打開DNA 的另一條鏈并產(chǎn)生缺口， 接著或在RNA/DNA 雜交分子轉(zhuǎn)變成雙鏈DN

16、A后，將其到切口的另一末端。,類病毒型返座子具有開放閱讀框和末端重復(fù)。,最典型的SINES由一個(gè)單一家族成員組 成。它們非常短并且有很高的重復(fù)性， 除其成員在整個(gè)基因組中散布分布而非 成簇分布外，與簡(jiǎn)單序列DNA 非常相像。,所有能被限制酶Alu酶切的序列都是 同一家族的成員，該家族稱為Alu 家族 (Alu family)。,許多假基因是由剪切連接的外顯子組成，但在DNA 中不存在識(shí)別內(nèi)含子的機(jī)制，所以此過程可能時(shí)通過RNA 中間體來完成。假基因通常以一段的AT 序列結(jié)尾，推測(cè)它可能來源于poly(A)尾。 假基因不編碼反轉(zhuǎn)錄酶，也不產(chǎn)生轉(zhuǎn)座酶，具有mRNA的特性，是非自主反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件。,假基因,轉(zhuǎn)座因子可作為基因的標(biāo)記克隆目的基因。 方法：從帶轉(zhuǎn)座因子生物篩選有突變品系。如果這些突變是由轉(zhuǎn)座子DNA克隆所產(chǎn)生，則必定有與該突變體有關(guān)的基因存在（用轉(zhuǎn)座子給未知目的基因加上標(biāo)記）以此突變基因的有關(guān)順序作探針從野