1、（Techniques of Molecular Markers）,分子標記技術(shù),課程基本情況:,教學(xué)目的: 使學(xué)生了解以Souther blot 、 PCR為基礎(chǔ),能用于遺傳多樣性研究的分子標記技術(shù),包括RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISH、DDRT-PCR、SNP 等. 教學(xué)內(nèi)容及基本要求: DNA結(jié)構(gòu)與功能；PCR技術(shù)；各種分子標記技術(shù) 基本原理；各種分子標記技術(shù)基本操作方法；分子標記技術(shù)的應(yīng)用；實驗中經(jīng)常遇到的問題及解決方法。 教學(xué)目標：使學(xué)生掌握常見分子標記技術(shù)使用的基本技能。 學(xué)習(xí)本課程的前期課程要求: 遺傳學(xué)、細胞生物學(xué)、分子生物學(xué). 教 材: 鄭成木 主編.植物分子標記

2、原理與方法. 湖南科技出版社, 2002年5月 考核：寫一份讀書報告，并做成PPT進行講解。,何謂讀書報告，就是讀完書之后的心得報告， 是閱讀者系統(tǒng)的收集、統(tǒng)整、研讀與創(chuàng)作主題相關(guān)的各種材料，經(jīng)分析、歸納、提煉等思維活動，提出個人見解和觀點的文字作品。 寫讀書報告的目的在于增加新知、提升研究和表達能力。,第一章 緒論,1.1 遺傳標記的類型及發(fā)展 1.2 遺傳物質(zhì)DNA 1.3 聚合酶鏈式反應(yīng)PCR 1.4 分子標記常用技術(shù)概述,1.1 遺傳標記的類型及發(fā)展,A genetic marker is any difference in DNA, no matter how it is detec

3、ted, whose pattern of transmission from generation to generation can be detected.,Genetic marker that are detected by direct analysis of the DNA are called DNA markers.,1.1 遺傳標記的類型及發(fā)展,遺傳標記(genetic markers)是研究生物遺傳變異規(guī)律及其物質(zhì)基礎(chǔ)的重要手段。遺傳標記主要有4種類型: 形態(tài)標記（morphological markers） 細胞學(xué)標記（cytological markers） 生化標記

4、（biochemical markers） 分子標記（molecular markers） 在植物遺傳育種研究中可被利用的遺傳標記應(yīng)具備以下幾個條件： （1）多態(tài)性高； （2）表現(xiàn)共顯性； （3）對農(nóng)藝性狀影響小； （4）經(jīng)濟方便，容易觀察記載。,多態(tài)性：群體內(nèi)存在著和等位基因相關(guān)的若干種表現(xiàn)型，是單一基因座等位基因變異性在群體水平的體現(xiàn)。 遺傳多態(tài)性發(fā)生于基因組群體內(nèi)，表現(xiàn)出由于等位基因受影響而產(chǎn)生不同的基因型，由此產(chǎn)生個體之間的多態(tài)性。 HLA基因多態(tài)性：人類白細胞抗原（HLA）的主要功能是參與自我識別、免疫調(diào)節(jié)和對異體移植物排斥反應(yīng)。 HLA-DRB1基因是最具多態(tài)性的基因，存在106個

5、等位基因，尤其是外顯子2處含有多達40個等位基因，最常見的有16個等位基因位點，此處含有與某些疾病的易感基因和保護基因。 共顯性：雜合子的一對等位基因各自都具有自己的表型效應(yīng)，當這一對等位基因雜合時，兩種表現(xiàn)型共存。便于鑒別基因的 純合或雜合。, 形態(tài)標記（morphological markers）,形態(tài)標記即植物的外部形態(tài)特征。 主要包括肉眼可見的外部特征，如：株高、穗長、粒色、花色、粒重等； 也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病蟲性等有關(guān)的一些特性。 1864年，孟德爾以豌豆的花色、種子形狀、子葉顏色、豆莢形狀、豆莢顏色、花序著生部位和株高7個不同的形態(tài)標記為對象，進行豌豆雜交試驗，對雜

6、交后代進行分析研究，得出了著名的分離和獨立分配規(guī)律。,形態(tài)標記簡單直觀、經(jīng)濟方便；但其數(shù)量在多數(shù)植物中是很有限的，且多態(tài)性較差，表現(xiàn)易受環(huán)境影響，并且有一些標記與不良性狀連鎖。此外形態(tài)標記的獲得需要通過誘變、分離純合的過程，周期較長。因此,形態(tài)標記在作物遺傳育種中的作用是有限的。, 細胞學(xué)標記（cytological markers）, 細胞學(xué)標記即植物細胞染色體的變異。各個物種的染色體都有特定的特征。 包括染色體核型（染色體數(shù)目、結(jié)構(gòu)、隨體有無、著絲粒位置等）和帶型（C帶、N帶、G帶等）的變化 與形態(tài)標記相比，細胞學(xué)標記的優(yōu)點是能進行一些重要基因的染色體或染色體區(qū)域定位。但細胞學(xué)標記材料需要

7、花費較大的人力和較長時間來培育，難度很大；同時某些物種對染色體變異反應(yīng)敏感；還有些變異難以用細胞學(xué)方法進行檢測。 因此，到目前為止，真正應(yīng)用于作物遺傳育種研究中的細胞學(xué)標記還很少。,染色體顯帶（chromosome banding）：借助于特殊的處理程序，使染色體顯出深淺不同的帶紋。染色體的數(shù)目、位置、寬窄與濃淡具有相對的穩(wěn)定性。 染色體帶型分析：通過蛋白酶或酸、堿、鹽等化學(xué)因素或溫度變化等物理因素處理染色體，然后用Giemsa、芥子喹吖因等染料進行染色，可使各對染色體上表現(xiàn)出不同的染色帶型或熒光域，因而可以在經(jīng)典的核型分析的基礎(chǔ)上，進一步根據(jù)染色體的帶型更精細地分析染色體。, 生化標記（bi

8、ochemical markers）, 生化標記主要包括同工酶和等位酶標記, 同工酶是指一個以上基因座位編碼的酶的不同形式; 等位酶是指由一個基因座位的不同等位基因編碼的酶的不同分子形式。 分析方法是從植物組織的蛋白粗提物中通過電泳和組織化學(xué)染色法將酶的多種形式轉(zhuǎn)變成肉眼可辯的酶譜帶型。 與形態(tài)標記、細胞學(xué)標記相比，生化標記具兩個方面的優(yōu)點： 一是表現(xiàn)近中性，對植物經(jīng)濟性狀一般沒有大的不良影響； 二是直接反映了基因產(chǎn)物差異，受環(huán)境影響較小。 但目前可使用的生化標記數(shù)量還相當有限，同時有組織特異性和發(fā)育時期特異性。且有些酶的染色方法和電泳技術(shù)有一定難度，因此其實際應(yīng)用受到一定限制。,同工酶與等位

9、酶電泳可區(qū)分的同一種酶（系統(tǒng)）的不同變化。,同工酶(isozyme)：廣義是指生物體內(nèi)催化相同反應(yīng)而分子結(jié)構(gòu)不同的酶。催化相同的化學(xué)反應(yīng)，但其蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和免疫性能等方面都存在明顯差異的一組酶 。 等位酶(allozyme)：由同一個位點的不同等位基因編碼的同種酶的不同類型，其功能相同但氨基酸序列不同。,同工酶與等位酶,材料的采集,研磨和酶的提取,酶的保存,凝膠制備,電泳,凝膠切片,酶的組織化學(xué)染色,酶譜的記錄與分析,數(shù)據(jù)分析,同工酶與等位酶,分析的過程,同工酶與等位酶, 酶譜照片,在生物學(xué)中，同工酶可用于研究物種進化、遺傳變異、雜交育種和個體發(fā)育、組織分化等。 例如最原始的脊椎動

10、物七鰓鰻（Lamprey）只有一種LDH肽鏈，進化到較高級的魚類才有A、B兩類肽鏈。 又如通過對地理分布不同的物種間某一同工酶譜的普查可以推測物種的地理來源、分類等。 動、植物的遺傳變異可通過子代和親代同工酶譜的比較來鑒別。法醫(yī)學(xué)中也可用多種同工酶譜的分析來鑒定親子關(guān)系。 細胞雜交或植物雜交育種后是否出現(xiàn)新品種也可用同工酶譜的比較來確定。 在個體發(fā)育中，從胚胎到出生，再到成年，隨著組織的分化和發(fā)育，各種同工酶譜也有一個分化轉(zhuǎn)變的過程。,酶是基因表達的直接產(chǎn)物，同工酶譜的器官組織特異性也反映了基因表達的特異性。 目前與性別分化有關(guān)的同工酶研究大多集中在過氧化物酶同工酶在雌雄器官中的差異研究。 早

11、在1972年，Penel等就注意到菠菜的性別差異與過氧化物酶同工酶譜帶的數(shù)目有關(guān)。 沈德緒認為葡萄和中華獼猴桃中雌株酶帶數(shù)也比雄株多。 范雙喜等對蘆筍雌雄株過氧化物酶同工酶(POD)進行了研究，結(jié)果表明雄株均比相應(yīng)的雌株少一條酶帶，說明蘆筍性別差異與過氧化物酶同工酶譜帶的數(shù)目有關(guān)，過氧化物酶同工酶譜的差異可以作為性別鑒定的指標。 另外在楊梅、獼猴桃等中也有過類似的報道。 應(yīng)振士等分析認為，過氧化物同工酶與雌性相關(guān)性的原因可能與其促進乙烯的釋放有關(guān)。,分子標記, 分子標記指能反映生物個體或種群間基因組中某種差異特 征的DNA片段，它直接反映基因組DNA間的差異。 與上述三種標記相比較，分子標記具

12、有許多明顯的優(yōu)越性，表現(xiàn)為： 直接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物體的各個組織、各個發(fā)育階段均可檢測到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達與否等問題. 數(shù)量極多，遍布整個基因組，可檢測座位幾乎無限. 多態(tài)性高，自然界存在許多等位變異，無須人為創(chuàng)造. 表現(xiàn)為中性，不影響目標性狀的表達. 許多標記表現(xiàn)為共顯性的特點，能區(qū)別純合體和雜合體.,廣義的分子標記是指可遺傳并可檢測的特異DNA序列或蛋白質(zhì)。 狹義的分子標記僅指DNA或(RNA)標記，而這個界定現(xiàn)在被廣泛采納。 目前，分子標記技術(shù)（這里指DNA或cDNA分子水平上的多態(tài)性檢測技術(shù)）已有:,RFLP (Restriction Fragment Lengt

13、h Polymorphisms)、 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)、 AFLP (Amplified fragment length polymorphisms)、 SSR (Simple sequence repeats)、 GISH (Genomic in situ hybridization) 、 mRNA DD (mRNA Differential Display) 、 SSH (Suppression Subtraction Hybridization) 、 AP-PCR (Arbitray-primer PCR)、 DAF (DNA

14、amplified fingprinting)、 SPARs (Single primer amplification reactions) 、 SCARs (Sequenced characteried amplified regions)、 AMO (Anchored Microsatellite Oligonucleotides) 、 STS (Sequenc-tagged Site) 、 SNP (Single Nucleotide Polymorphism) .,分子標記的種類與歷史,蛋白質(zhì)：同工酶(等位酶)上世紀六十年代以來 核苷酸序列和片段：tRNA（1965） 1980年以來：

15、RFLP 1984年以來：SSR 1990年以來：RAPD 1993年以來：AFLP 1996年以來：DDRT-PCR,1.2 遺傳物質(zhì)DNA, DNA結(jié)構(gòu)原理 DNA分子的結(jié)構(gòu)與功能 DNA的理化性質(zhì)及應(yīng)用,1.2.1 DNA結(jié)構(gòu)原理, DNA雙螺旋的發(fā)現(xiàn) 典型雙螺旋結(jié)構(gòu),DNA雙螺旋的發(fā)現(xiàn),Oswald Avery (1877-1955) Microbiologist Avery led the team that showed that DNA is the unit of inheritance. One Nobel laureate has called the discovery

16、the historical platform of modern DNA research, and his work inspired Watson and Crick to seek DNAs structure., 1943年Avery證明DNA攜帶遺傳信息,Erwin Chargaff (1905-2002) Chargaff discovered the pairing rules of DNA letters, noticing that A matches to T and C to G. He later criticized molecular biology, the d

17、iscipline he helped invent, as the practice of biochemistry without a licence, and once described Francis Crick as looking like a faded racing tout., 1949年Chargaff發(fā)現(xiàn)A與T及C與G 配對現(xiàn)象,Rosalind Franklin (1920-58) Franklin, trained as a chemist, was expert in deducing the structure of molecules by firing X-

18、rays through them. Her images of DNA - disclosed without her knowledge - put Watson and Crick on the track towards the right structure. She went on to do pioneering work on the structures of viruses. Maurice Wilkins (1916- ) Like Crick, New Zealand-born Wilkins trained as a physicist, and was involv

19、ed with the Manhattan project to build the nuclear bomb. Wilkins worked on X-ray crystallography of DNA with Franklin at Kings College London, although their relationship was strained. He helped to verify Watson and Cricks model, and shared the 1962 Nobel with them., 1952年底得到DNA的X-射線衍射圖像,Linus Pauli

20、ng (1901-94) The titan of twentieth-century chemistry. Pauling led the way in working out the structure of big biological molecules, and Watson and Crick saw him as their main competitor. In early 1953, working without the benefit of X-ray pictures, he published a paper suggesting that DNA was a tri

21、ple helix., 1953年初提出了DNA的三螺旋模型,James Watson (1928- ) Watson went to university in Chicago aged 15, and teamed up with Crick in Cambridge in late 1951. After solving the double helix, he went on to work on viruses and RNA, another genetic information carrier. He also helped launch the human genome pr

22、oject, and is president of Cold Spring Harbor Laboratory in New York. Francis Crick (1916- ) Crick trained and worked as a physicist, but switched to biology after the Second World War. After co-discovering the structure of DNA, he went on to crack the genetic code that translates DNA into protein.

23、He now studies consciousness at Californias Salk Institute., 1953年提出了DNA的雙螺旋模型,腺嘌呤A,鳥嘌呤G,胸腺嘧啶T,胞嘧啶C,尿嘧啶U,-D-核糖,-D-2-脫氧核糖,1.2.2 DNA分子的結(jié)構(gòu)與功能, DNA的超螺旋結(jié)構(gòu) 原核生物：大部分原核生物的DNA是共價封閉的環(huán)狀雙螺旋，這種雙螺旋還可以再次螺旋化形成超螺旋。 真核生物：DNA和蛋白質(zhì)組裝成染色體，染色體的基本單位是核小體。 核小體由DNA和組蛋白構(gòu)成。組蛋白有H1，H2A，H2B，H3和H4。 H2A，H2B，H3和H4各兩分子構(gòu)成核小體的核心，稱為組蛋白八聚

24、體。DNA雙螺旋分子纏繞在八聚體上構(gòu)成核小體的核心顆粒。核小體的核心顆粒之間再由DNA和組蛋白H1構(gòu)成的連接區(qū)連接起來形成串珠狀結(jié)構(gòu)。核小體進一步旋轉(zhuǎn)折疊形成棒狀染色體，將近1 m長的DNA分子容納于直徑只有數(shù)微米的細胞核中。, DNA的功能, DNA的基本功能作為生物遺傳信息復(fù)制的模板和基因轉(zhuǎn)錄的模板，它是遺傳繁殖的物質(zhì)基礎(chǔ)。 基因組（genome）： 一個生物體的全部基因序列。最簡單的生物如SV40病毒的基因組僅含有5100堿基對（base pair bp）， 大腸桿菌基因組的大小為5700千堿基對（kbp），人的基因組則由大約3.0109個bp組成。,1.2.3 DNA的理化性質(zhì)及應(yīng)用,

25、核酸的一般理化性質(zhì): 多元酸，較強的酸性; DNA為線性高分子，粘度極大，而 RNA分子遠小于DNA，粘度也小得多; 由于堿基成分的紫外吸收特征，DNA和RNA溶液均具有260nm紫外吸收峰。, DNA的變性, DNA變性：在某些理化因素作用下，DNA分子互補堿基對之間的氫鍵斷裂，使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)松散，變成單鏈。監(jiān)測指標為A260的變化。 常用的變性方法為加熱。 增色效應(yīng)（hyperchromic effect）：DNA解鏈過程中，其A260增加，并與解鏈程度有一定的關(guān)系 解鏈曲線：在連續(xù)加熱過程中以溫度對A260的關(guān)系作圖。 解鏈溫度：DNA變性從開始到完全解鏈是在一個相當窄的范圍內(nèi)完成

26、的。這一范圍內(nèi)A260達到最大值的50%時的溫度稱為解鏈溫度，又稱為融解溫度（melting temperature，Tm）。 Tm的大小與其所含堿基中的G+C比例相關(guān)，G+C比例越高，Tm值越高。, DNA的復(fù)性,復(fù)性: 變性DNA在適當條件下，兩條互補鏈可重新恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象，稱為復(fù)性。熱變性DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，也稱為退火（annealing）。 DNA復(fù)性速度受溫度的影響，復(fù)性時溫度緩慢下降才可使其重新配對復(fù)性；如加熱后將其迅速冷卻至4 以下，則不可能發(fā)生復(fù)性。比Tm低25為DNA復(fù)性的最佳條件。, DNA分子雜交(hybridization),雙鏈DNA,單鏈DNA,雜交,

27、在DNA復(fù)性過程中，雙鏈分子的再形成可以發(fā)生在序列完全互補的核酸分子之間，也可以發(fā)生在堿基序列部分互補的不同的DNA之間或DNA與RNA之間 ，這種現(xiàn)象稱為分子雜交。,（polymerase chain reaction）,1.3 聚合酶鏈式反應(yīng),關(guān)于PCR，您能告訴我們,聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction)簡稱，是一項在短時間內(nèi)大量擴增特定的片段的分子生物學(xué)技術(shù)。,無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進行比對。這也是“微量證據(jù)”的威力之所在。, PCR技術(shù)簡史

28、, PCR的最早設(shè)想 核酸研究已有100多年的歷史，上世紀60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)，Khorana于1971年最早提出核酸體外擴增的設(shè)想：“經(jīng)過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”。 PCR的實現(xiàn) 1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供一種合適的條件模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時間。, Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿

29、菌DNA聚合酶I的Klenow片段。 缺點：不耐熱 1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶。 缺點：不耐熱 1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶命名為Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。 優(yōu)點：耐熱 此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用。, PCR的改進與完善:,Old Faithful Geyser - Yellowstone National Park,An alien and inhospitable place, characterized by extreme

30、 heat, spewing steam into the frigid air such is the scene of old faithful geyser in Yellowstone National park. This seemingly prohibitive habitat is home to Thermus aquaticus, the bacterium from which the heat stable DNA polymerase essential to PCR is obtained.,Kary Mullis accepting the Nobel Prize

31、,Brilliant, gifted, genius, rebel Dr Kary Mullis has been thus described, and more. Mullis discovered the PCR procedure, for which he was awarded the Nobel prize in 1993. The procedure he devised has revolutionized molecular biology, forensics, and DNA based identification technology.,PCR儀,1.3.1 PCR

32、原理,模板,PCR原理,變性,5,3,5,3,復(fù)性,PCR原理,引物,引物,5,3,5,3,延伸,PCR原理,變性,PCR原理,復(fù)性,PCR原理,延伸,PCR原理,變性,PCR原理,復(fù)性,PCR原理,延伸,PCR原理,DNA以指數(shù)形式擴增(2n)，其中長片段以線性形式擴增 (2n+2)，最終主產(chǎn)物片段長度在兩個引物之間。,預(yù)變性 (92-95C,2-5m),變性 (92-95C,30s),復(fù)性 (40-60C,30s),延伸(72C,30-60s),總延伸(72C,7m),(25-35),PCR的一般過程,經(jīng)過30次循環(huán), 擴增的DNA片段可達100萬倍以上。, PCR產(chǎn)物的積累規(guī)律 DNA擴

33、增過程遵循酶促動力學(xué)原理。 反應(yīng)初期，目的DNA片段呈指數(shù)形式（2n）增加，隨著目的DNA的積累，在引物、模板與DNA聚合酶達到一定比例時，酶的催化反應(yīng)趨于飽和平臺期 。（25個循環(huán)）, PCR反應(yīng)的自動化, PCR反應(yīng)五要素： 引物、酶、dNTP、模板和 Mg2+ Taq DNA聚合酶 來源：水生棲熱菌 Thermus aquaticus 特性：良好的耐熱性 Mg2+依賴性 無校正功能,1.3.2 PCR引物設(shè)計, 引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。 引物擴增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長 10kb的片段。 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴

34、增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩引物間互補，特別是3端互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異擴增條帶. 引物3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。 引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。 引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。,1.3.3 模板的制備,DNA 從細胞中提取DNA： 動、植物細胞、絨毛、尿樣、毛發(fā)、口腔上皮細胞等 固定和包埋的組織標本：

35、 脫蠟、蛋白酶K消化 RNA 新鮮組織或細胞 所用器皿和試劑必需經(jīng)高溫滅菌或DEPC處理,1.3.4 PCR的基本反應(yīng), 以DNA為模板的反應(yīng)： 10緩沖液 10 l 4種dNTP混合物 各20 mol 引物 各10100 pmol 模板DNA 0.12 g Taq DNA聚合酶 2.5 u Mg2+ 1.5 mmol 加雙蒸水至 100 l, 以mRNA為模板的反應(yīng) mRNA 5 l(約500ng) 5 Buffer 4 l dNTPs 2 l(10mmol/L) RNasin 1 l(20U) AMV RTase 1 l(10U) Oligo(dT)1218(或下游引物) 1 l ddH2

36、O 6l Total 20 l,42水浴1小時，95 水浴10分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。向上述反應(yīng)體系中添加如下試劑：,10 Buffer 5 l 25mmol/L Mg2+ 3l Taq酶 0.5 l（2.5U） 上游引物 1l ddH2O 20.5l Total 50 l,按PCR循環(huán)參數(shù)進行RT-PCR,1.3.5 PCR反應(yīng)條件的控制,（一）PCR反應(yīng)的緩沖溶液 提供合適的酸堿度和某些離子 1050mmol/L Tris-HCl緩沖液 50mmol/L KCl BSA或明膠 （二）鎂離子濃度 Taq酶活性需要Mg2+ ， Mg2+濃度過高導(dǎo)致非特異擴增。 一般常用1.5 mmol/L,（三）底

37、物濃度 dNTP濃度在20200 mol/L 四種dNTP必須濃度相等 （四） Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶在7080具有最高聚合活性,（五）引物 引物濃度一般為0.1 0.5mol/L （六）反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù) 預(yù)變性溫度和時間 95/5min 變性溫度和時間 95/30 60s 退火溫度和時間 4555/30 60s 延伸溫度和時間 72 /30 60s 循環(huán)次數(shù) 2530,1.3.6 PCR中應(yīng)注意的事項, PCR反應(yīng)中可能出現(xiàn)的問題： 假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶 假陽性 出現(xiàn)非特異擴增帶,（一）防止污染 試劑小量分裝 吸頭及EP管一次性使用 器皿及工作區(qū)域要分開，無菌操作 （

38、二）設(shè)立對照： 陽性對照： 陽性模板 陰性對照： 陰性模板 試劑對照： 除模板外的所有組分, 注意的事項：,1.3.7 PCR反應(yīng)的特點, 簡便、快速： PCR反應(yīng)一般在24 小時完成擴增反應(yīng)。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。, 對標本的純度要求低： 不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞，DNA 粗制品及總RNA均可作為擴增模板?？芍苯佑弥参锝M織、細胞，臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等粗制的DNA擴增檢測。, 特異性強：, 靈敏度高： PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10- 12)量級的起始待測模板擴增到微克(g=10-6)水

39、平。,1.3.8 PCR的應(yīng)用,PCR技術(shù)自從1988年正式推出后，迅速風靡于世，被廣泛用于DNA酶促擴增、RNA酶促擴增、直接DNA序列測定，甚至對細胞內(nèi)稀有DNA進行定量測定。 但PCR技術(shù)也存在一些缺點：擴增DNA的長度一般不超過2kb，TaqDNA聚合酶在合成作用時也會發(fā)生錯誤，出錯率0.25，費用比較昂貴。目前人們正在設(shè)法克服這些缺點，而發(fā)揮PCR技術(shù)的長處。,在分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究上，被廣泛地用基因克隆和制造突變。 在臨床醫(yī)學(xué)上，被用于鑒別遺傳疾病和快速檢測病毒、病菌感染。用傳統(tǒng)的方法，要檢測病毒病菌的感染需要把病原體培養(yǎng)數(shù)周才能鑒定，而現(xiàn)在用，即可以迅速判斷人體細胞（比如血液細胞）

40、中是否存在病毒、病菌的（比如的）而確診。 在法醫(yī)上，目前已成為發(fā)現(xiàn)罪證的重要方法。比如，微升的唾液痕跡所含的就可以通過擴增而獲得足夠量的進行測序鑒定罪犯。毛發(fā)、血跡、唾沫、精液因此都可以成為重要的罪證。 利用技術(shù)，科學(xué)家們已從林肯的頭發(fā)和血液、埃及的木乃伊、琥珀中八千萬年前的昆蟲、恐龍的骨頭等不尋常的樣品中提取了足夠的進行研究。博物館中的化石標本都有可能成為遺傳學(xué)的研究對象，一門分子古生物學(xué)因此誕生。, DNA鑒定簡介,DNA分析應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)鑒定是近十年來的事，目前發(fā)現(xiàn)的DNA多態(tài)位點越來越多，分析技術(shù)越來越精巧、簡便、快速、經(jīng)濟，實用。 世界上有120多個國家和地區(qū)已應(yīng)用DNA分析技術(shù)辦案，

41、解決刑事（如殺人）、民事（親子鑒定）糾紛問題，以及追查尸體身源，包括戰(zhàn)爭及大型災(zāi)難中落難者的個人識別等，個人同一認定接近100%。 DNA分析的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用使以往只能檢測基因編碼的酶或蛋白質(zhì)水平飛躍到直接檢查基因的分子水平，是法學(xué)物證檢驗史上的一場重大的革新。, DNA鑒定過程,1.4 分子標記常用技術(shù)概述, 限制性擴增片段長度多態(tài)性（RFLP） 隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD） 擴增片段長度多態(tài)性（AFLP） 簡單重復(fù)序列（SSR） 染色體原位雜交（GISH或FISH） mRNA差異顯示法（mRNA DD）,1.4.1 限制性酶切片段長度多態(tài)性 (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP),8kb,5kb,3kb,在個體和群體中，片段長度表現(xiàn)出多態(tài)性。 如3kb, 5kb, 7kb, 8kb RFLP呈現(xiàn)孟德爾式遺傳。 常用檢查方法：核酸雜交；PCR-酶切等。,probe,產(chǎn)生多態(tài)性的原因是內(nèi)切酶位點的變化:原位點的消失；新位點的產(chǎn)生。,GAATTCCTTAAG,GATTTCCTAAAG,2kb,3kb,5kb,7kb,1.4.2 隨機擴增多態(tài)性DNA（RAP