1、神經(jīng)生物學(xué)緒論,NEUROBIOLOGY INTRODUCTION,劉 寧,5,1.1 概念與任務(wù) 在分子、細(xì)胞、組織器官和整體等多個(gè)水平上研究神經(jīng)系統(tǒng)的形態(tài)和功能的學(xué)科。,6,任務(wù)：研究神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)分子水平、細(xì)胞水平和系統(tǒng)水平的變化過(guò)程，以及這些過(guò)程的整合作用，直至最復(fù)雜的高級(jí)功能，如學(xué)習(xí)、記憶等,目的：了解人類(lèi)神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，以及行為與心理活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，闡明行為和心理活動(dòng)的神經(jīng)機(jī)制，為改善人類(lèi)感覺(jué)與運(yùn)動(dòng)效率，提高對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的防治水平以及增進(jìn)健康服務(wù),7,內(nèi)容: 神經(jīng)解剖、生理、藥理、病理、生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)等跨學(xué)科的基本理論研究,特點(diǎn)： 1、包羅了基礎(chǔ)神經(jīng)科學(xué)的諸多

2、學(xué)科 2、并非若干傳統(tǒng)學(xué)科簡(jiǎn)單和機(jī)械地組合 3、在傳統(tǒng)神經(jīng)科學(xué)的基礎(chǔ)之上成長(zhǎng)和發(fā)展起來(lái)的一門(mén)新興的綜合性的邊緣學(xué)科,8,主要研究領(lǐng)域,神經(jīng)生物化學(xué)（neurobiochemistry）,神經(jīng)生理學(xué)（neurophysiology）,細(xì)胞神經(jīng)生物學(xué)（cellular neurobiology）,分子神經(jīng)生物學(xué)（molecular neurobiology）,發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)（developmental neurobiology）,比較神經(jīng)生物學(xué)（comparative neurobiology）,系統(tǒng)神經(jīng)生物學(xué)（systematic neurobiology）,9,人類(lèi)對(duì)自身學(xué)習(xí)記憶思維等能力的探

3、索 了解腦是怎樣工作對(duì)整個(gè)生物科學(xué)的激勵(lì)作用 對(duì)唯心主義哲學(xué)的挑戰(zhàn) 更清楚的了解人類(lèi)自身，提高人的素質(zhì)，緩解人類(lèi)矛盾,為什么要重視神經(jīng)生物學(xué)？,10,1.2 神經(jīng)生物學(xué)發(fā)展和展望,22,神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)研究 19世紀(jì)80年代Cajal建立起神經(jīng)元理論 19世紀(jì)末和20世紀(jì)初，Sherrington關(guān)于 “反射”“突觸” 、“神經(jīng)傳遞”的概念 20世紀(jì)20到50年代通過(guò)高倍電鏡對(duì)突觸結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)的觀察,Pictures of Spanish anatomist Ramon y Cajal,26,First page of Sherringtons famous book, The Integrative

4、 Action of the Nervous System (1906); this is the 5th edition of 1947,28,2. 神經(jīng)興奮的電傳導(dǎo) 1791年Galvani就發(fā)現(xiàn)了生物電現(xiàn)象 19世紀(jì)電生理方法測(cè)定神經(jīng)電傳導(dǎo)的速度，發(fā)現(xiàn)“全或無(wú)”定律等 20世紀(jì)30年代Young以烏賊大神經(jīng)纖維作為研究材料，定量的測(cè)量神經(jīng)電傳導(dǎo)的電阻、電位及其在刺激前后的變化等 40年代Hodgkin、Huxley和Katz等研究Na+、K+與神經(jīng)傳導(dǎo)的關(guān)系，測(cè)定靜息電位、動(dòng)作電位等,29,意大利科學(xué)家伽伐尼（Luigi Galvani, 17371798),Diagram of Gal

5、vani s frog legs (1770s),1937Young 推測(cè)可以使用巨大烏賊的軸突來(lái)了解神經(jīng)細(xì)胞,John Zachary Young (1907-1997),31,A.L Hodgkin,A.F. Huxley,They shared the 1963 Nobel Prize in Physiology or Medicine for work on the transmission of signals from nerve cells.,John Carew Eccles,32,3. 神經(jīng)化學(xué)遞質(zhì)研究 1905年Eliot發(fā)現(xiàn)電脈沖到達(dá)肌肉連結(jié)點(diǎn)時(shí)釋放了腎上腺素 1921年

6、Loewi的蛙心實(shí)驗(yàn)，直接證明在心肌上的交感和副交感神經(jīng)末梢分別釋放出兩種不同的化學(xué)物質(zhì) 1932年前后，Dale的系列的實(shí)驗(yàn)，取得了乙酰膽堿存在于內(nèi)臟器官神經(jīng)末梢的直接證據(jù) 19341935年Cannon等提取交感神經(jīng)末梢遞質(zhì)，1946年Eule闡明其為去甲腎上腺素 1960年以來(lái)，對(duì)腦內(nèi)遞質(zhì)開(kāi)展了不少研究，發(fā)現(xiàn)了約30種不同的遞質(zhì) 20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)腦啡肽等,33,4. 腦功能研究 1893年起Sherrington研究反射弧，提出抑制的概念，并認(rèn)為抑制過(guò)程同興奮過(guò)程同等重要 Pavlov在20世紀(jì)初建立起“條件反射”的概念，證明條件反射是大腦活動(dòng)的結(jié)果,19世紀(jì)有學(xué)者提出關(guān)于腦功能區(qū)的

7、定位，部分切除狗腦皮層手術(shù)成功，并通過(guò)對(duì)尸體解剖的觀察開(kāi)始研究人大腦皮層功能區(qū),34,20世紀(jì)30年代Foerster和Penfield在利用外科手術(shù)在清醒的病人身上，用電刺激大腦的不同部位引起不同反應(yīng) 20世紀(jì)40年代Sperry開(kāi)始用貓和猴子做實(shí)驗(yàn)，切斷大腦兩半球間的連接，進(jìn)行觀察。 60年代，對(duì)癲癇病人作兩半球割裂治療的觀察,36,80年代，Sperry闡明人腦的左半球除具有抽象思維、數(shù)學(xué)運(yùn)算及邏輯語(yǔ)言等各項(xiàng)重要機(jī)能外，還可以在關(guān)系很遠(yuǎn)的資料間建立想象聯(lián)系，在控制神經(jīng)系統(tǒng)方面人腦的左半球也很積極，起著主要作用。 還發(fā)現(xiàn)人腦右半球也同樣具有許多高級(jí)功能，如對(duì)復(fù)雜關(guān)系的理解能力、整體的綜合能

8、力、直覺(jué)能力、想象能力等；此外，它還被證實(shí)是音樂(lè)、美術(shù)及空間知覺(jué)的辨識(shí)系統(tǒng)，因此人的右腦蘊(yùn)藏著很大的潛力。,38,19世紀(jì)70年代Caton對(duì)兔、貓以及猴的實(shí)驗(yàn)表明大腦普遍存在著電的變化 20世紀(jì)開(kāi)始作腦電記錄，Berger發(fā)現(xiàn)有心理活動(dòng)時(shí)（如注意等）腦電波發(fā)生變化 20世紀(jì)50年代開(kāi)始，腦電的研究向探索與特定知覺(jué)有關(guān)的信號(hào)方向發(fā)展，開(kāi)始了誘發(fā)電位的研究工作 60年代，引入傅里葉分析儀 70年代對(duì)人的視覺(jué)、聽(tīng)覺(jué)、甚至嬰兒的感覺(jué)，都有了靈敏的檢查指標(biāo),39,5. 神經(jīng)系統(tǒng)感知研究 20世紀(jì)發(fā)展最快的是中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)外界感覺(jué)的加工、識(shí)別信號(hào)、形成感知,測(cè)謊儀,百年來(lái)與神經(jīng)科學(xué)有關(guān)的諾貝爾獎(jiǎng)獲得者選

9、介(I),C.S.Sherrington (英),1857,1850,1900,1950,2000,C.Golgi (意),1926,1934,神經(jīng)元染色方法,1843,1852,R.Cajal (西班牙),“神經(jīng)元學(xué)說(shuō)”,形態(tài),1906,1952,1932,“突觸”定名 “反射”概念 “交互”抑制,反射學(xué)說(shuō),1889,1977,感覺(jué)神經(jīng)纖維電活動(dòng) 傳入沖動(dòng)大腦誘發(fā)電位 神經(jīng)控制骨骼肌運(yùn)動(dòng)機(jī)制,E.D.Adrian (英),電生理,O.Loewi (德 英),1961,1873,1936,蛙心灌流實(shí)驗(yàn) “迷走物質(zhì)”,1968,1875,H.Dale (英),神經(jīng)末梢分泌 乙酰膽堿ACh,神經(jīng)化

10、學(xué),1874,1965,1944,1963,1888,J.Erlanger (美),H.S.Gasser (美),陰極射線示波器 神經(jīng)纖維的分類(lèi)ABC,1973,1881,W.R.Hess (瑞士),腦立體定位儀 hypothalamus,方法學(xué)創(chuàng)新,1949,電生理,Oxf,Cambridge,徒手切腦片銀染神經(jīng)元,染出神經(jīng)末梢，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元之間無(wú)原生質(zhì)聯(lián)系,生理科學(xué)進(jìn)展 2001，32：187,神經(jīng)藥理學(xué),分子藥理學(xué),百年來(lái)與神經(jīng)科學(xué)有關(guān)的諾貝爾獎(jiǎng)獲得者選介(II),1850,1900,1950,2000,J.C. Eccles (澳大利亞),1914,1903,1963,A.L.Hodgk

11、in (英),B.Katz (德 英),1917,A.F.Huxley (英),細(xì)胞內(nèi)微電極 突觸后電位 抑制性遞質(zhì),突觸,電壓鉗技術(shù) 動(dòng)作電位的離子學(xué)說(shuō) 數(shù)學(xué)方程表述, NM終板電位 遞質(zhì)“量子釋放”,1911,動(dòng)作電位機(jī)制,1905,1983,U.Von Euler (瑞典),交感神經(jīng)遞質(zhì) 去甲腎上腺素,1970,兒茶酚胺代謝 影響CAs的藥物,電生理,1912,J.Axelrod (美),（兒茶酚胺）,神經(jīng)化學(xué),1913,(左右腦),R.W.Sperry (美),1981,“腦功能側(cè)化”,D.Hubel (加 美),1926,1924,T.Wiesel (瑞典 美),信息加工,視皮層,E

12、.Neher (德),1991,B.Sakmann (德),大腦視覺(jué)信息加工 視覺(jué)系統(tǒng)發(fā)育的可塑性,膜片鉗技術(shù) 單個(gè)離子通道電流記錄,1999,英，澳,Cambridge,Cambridge,Levi Montalcini 1986 Nerve growth Factor (NGF) (Italy),百年來(lái)與神經(jīng)科學(xué)有關(guān)的諾貝爾獎(jiǎng)獲得者選介(3),1850,1900,1950,2000,1926,1923,2000,P.Greengard (美),1930,E.Kandel (美),A.Carlsson (瑞典),神經(jīng)系統(tǒng)中 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),蛋白磷酸化 慢突觸傳遞 多巴胺,中 國(guó) 神 經(jīng) 科 學(xué)

13、的 發(fā) 展 開(kāi) 創(chuàng) 者: 張錫鈞(協(xié)和), 馮德培(協(xié)和,上海生理所),張香桐(上海生 理所,腦所). 兩大事件: 1950: 巴甫洛夫“條件反射”學(xué)說(shuō) 1966-1976: “文化革命”期間主要做“針刺麻醉” 研究方向: 痛與鎮(zhèn)痛: 北京: 北醫(yī),中醫(yī)研究院 上海: 上醫(yī)大,中科院生理所, 腦所，神科所 視 覺(jué): 上海: 生理所 北京: 生物物理所 神經(jīng)內(nèi)分泌: 西安: 四軍大 (垂體前葉) 上海: 二軍大 (甾體受體), 北醫(yī)大(神經(jīng)免疫) 其它（發(fā)育，再生，）,雜 志:生理學(xué)報(bào)70%論文屬神經(jīng)生理 1927年創(chuàng)刊 (上海生理所) 中國(guó)神經(jīng)科學(xué)雜志 1998年創(chuàng)刊 (上海二軍大) 中國(guó)疼痛

14、醫(yī)學(xué)雜志 1995年創(chuàng)刊 (北醫(yī)大) 中國(guó)神經(jīng)解剖雜志 1985年創(chuàng)刊 (四軍大解剖系） 大型專(zhuān)著: 神經(jīng)科學(xué)綱要 1993年 北醫(yī)大韓濟(jì)生主編 (156萬(wàn)字) 神經(jīng)科學(xué)原理 1999年 北醫(yī)大韓濟(jì)生主編 (200萬(wàn)字),1.3 特點(diǎn)：,（1）神經(jīng)生物學(xué)具有清晰的發(fā)展脈絡(luò) 起初是對(duì)腦和神經(jīng)系統(tǒng)的形態(tài)和總體功能的描述和分析； 之后有更多的學(xué)科從不同側(cè)面介入其中，日益迅速地把研究推向了細(xì)胞和分子水平。 人們已經(jīng)不再停留在現(xiàn)象的描述，而是更著眼于在不同層次上的機(jī)制的分析，從現(xiàn)象深入到機(jī)制是現(xiàn)代自然科學(xué)發(fā)展的共同特點(diǎn)，神經(jīng)生物學(xué)可以說(shuō)是其縮影。,（2）作為一門(mén)實(shí)驗(yàn)科學(xué)，神經(jīng)生物學(xué)研究的進(jìn)展在很大程度上

15、有賴(lài)于研究技術(shù)和手段的發(fā)展和完善 在20世紀(jì)初，Cajal對(duì)神經(jīng)元形態(tài)的清晰描述，幾乎完全仰仗于Golgi銀染法的應(yīng)用。 40年代末，微電極記錄和染色技術(shù)的發(fā)展使人們對(duì)神經(jīng)活動(dòng)的認(rèn)識(shí)出現(xiàn)了革命性的變化。免疫組織化學(xué)方法的應(yīng)用，使對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的研究與形態(tài)學(xué)研究有機(jī)地結(jié)合起來(lái)。,膜片鉗位技術(shù)在20世紀(jì)70年代末的發(fā)明和發(fā)展，大大促進(jìn)了對(duì)離子通道的研究，從而使人們對(duì)神經(jīng)活動(dòng)基本過(guò)程信號(hào)發(fā)生、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、突觸傳遞等的了解奠定在更堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)上。 分子遺傳學(xué)方法的不斷更新，不僅使不少遺傳性神經(jīng)、精神疾患的缺損基因的定位得以成功，對(duì)了解特定基因在神經(jīng)系統(tǒng)中的功能也起了重要的推動(dòng)作用。 無(wú)創(chuàng)傷腦成象技術(shù)的建立和完

16、善，為認(rèn)識(shí)活體腦的活動(dòng)及分析其機(jī)制，提供了前所未有的有力工具。,（3）從神經(jīng)生物學(xué)的發(fā)展史中，找到合適的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本很重要 早期對(duì)神經(jīng)興奮和動(dòng)作電位傳導(dǎo)規(guī)律的闡明，槍烏賊大神經(jīng)標(biāo)本功不可沒(méi)； 對(duì)突觸傳遞過(guò)程的了解，神經(jīng)-肌肉接頭標(biāo)本所提供的信息，則甚于其他任何標(biāo)本。 近年來(lái)，對(duì)腦的高級(jí)功能學(xué)習(xí)和記憶的基本機(jī)制的了解，在許多方面，依賴(lài)對(duì)一種低等的無(wú)脊椎動(dòng)物海兔的簡(jiǎn)單的神經(jīng)系統(tǒng)的研究。,(一) 形態(tài)學(xué)方法,辣根過(guò)氧化物酶法（horseradish peroxdase, HRP）： HRP注射于神經(jīng)末梢所在部位，通過(guò)非特異性胞飲方式攝入，逆向運(yùn)至胞體，然后用組織化學(xué)方法顯示?；蚪?jīng)胞體攝入，順向運(yùn)送至末梢

17、部位。,1.束路追蹤法,1.4 研究方法：,熒光染料法： 主要用作逆向追蹤，其優(yōu)點(diǎn)是可作雙標(biāo)或多標(biāo)。如核黃標(biāo)記胞核，固藍(lán)或熒光金標(biāo)記胞質(zhì)。,生物素追蹤法： 一般使用生物素的衍生物作追蹤劑，如生物胞素（biocytin）電泳導(dǎo)入腦內(nèi)被神經(jīng)元攝取，主要用于順向追蹤。該法有效范圍明確，無(wú)過(guò)路纖維吸收問(wèn)題。神經(jīng)生物素（neurobiotin）用于順行、逆行追蹤，運(yùn)送速度較快，靈敏度高。,2. 免疫組化法(immunohistochemistry) 用特異性抗體顯示組織化學(xué)成分的一種方法。免疫組化法的基本步驟有固定、制片、反應(yīng)三步。常用于顯示各種神經(jīng)肽。,3. 原位雜交法 ( in situ hybri

18、dization) 用于顯示細(xì)胞內(nèi)的mRNA，標(biāo)記物分為同位素和非同位素，同位素有32P，35S，3H。非同位素有生物素(biotin)，地高辛等。,4. 激光共聚焦顯微鏡 (laser scanning confocal microscopy ) 用0.2 m的光束可透射厚0.51mm的細(xì)胞組織，用于神經(jīng)遞質(zhì)、受體和轉(zhuǎn)運(yùn)體的定位；神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的三維重建；活的神經(jīng)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化；也可對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)掃描，顯示細(xì)胞內(nèi)某種成分（如Ca 2+ ）的變化過(guò)程，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、染色體等的探測(cè)和分析，DNA、RNA、酶的含量測(cè)定。,(二) 生理學(xué)方法,1. 行為學(xué)方法 行為學(xué)方法是建立在條件反射基

19、礎(chǔ)之上。條件反射是著名的俄國(guó)生理學(xué)家巴甫洛夫于20世紀(jì)初提出的。條件反射是動(dòng)物個(gè)體生活過(guò)程中適應(yīng)環(huán)境的變化，在非條件反射基礎(chǔ)上逐漸形成的。,2. 神經(jīng)遞質(zhì)釋放量的測(cè)定,腦透析法： 可測(cè)定不同腦區(qū)的多巴胺及其代謝產(chǎn)物，氨基酸，乙酰膽堿，去甲腎上腺素，5HT等。神經(jīng)肽的測(cè)定較難，主要由于探頭半透膜要求較高。,1. 電壓鉗 (voltage clamp),Hodgkin等，20世紀(jì)50年代 電壓電極、電流電極 反饋放大器 (feedback amplifer) 結(jié)合藥理學(xué)方法,(三) 電生理學(xué)方法,2. 膜片鉗 (patch clamp),Neher和Sakmann，1976（nAchR單離子通道電

20、流，1991，Noble ） 可測(cè)量單通道離子電流 現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)：通道的開(kāi)放和關(guān)閉都是突然發(fā)生并似乎是全或無(wú)式的，開(kāi)放的持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)短不一，但都有恒定的電導(dǎo)值。,(四)生物化學(xué)方法,1. 放射免疫法(radioimmunoassay, RIA) 用抗原抗體反應(yīng)原理，將抗原標(biāo)記上放射性同位素，用來(lái)測(cè)定與此抗原性質(zhì)相同的物質(zhì)。RIA包括以下基本步驟：樣品采集、加樣、反應(yīng)、分離、測(cè)定抗原抗體復(fù)合物的放射性（cpm）, 與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照計(jì)算待測(cè)物質(zhì)含量。,2.高效液相層析 ( high performance liquid chromatography, HPLC) 利用分子間特異性及可逆性的結(jié)合，將其一方固

21、定于層析的固定相中，使流動(dòng)相中能特異性結(jié)合于該分子的物質(zhì)與其結(jié)合，然后再改變條件，使被分離物質(zhì)洗脫，用一定波長(zhǎng)紫外光檢測(cè)。 HPLC是分離分析生物活性物質(zhì)和受體的重要手段。,(五)分子生物學(xué)方法,1. 基因分子克隆及表達(dá) 人類(lèi)染色體大約有3109堿基和5-10萬(wàn)個(gè)基因?；蚩寺∈翘囟ɑ驈幕蚪M中分離出來(lái)在細(xì)菌中擴(kuò)增的過(guò)程?？寺』蚰康氖谦@得大量的純DNA分子。 2. PCR PCR是一種酶促化學(xué)反應(yīng),可在含有多種核酸分子的混合液中選擇性地大量擴(kuò)增某一種核酸分子的特定序列。該方法具有極高的靈敏度和特異性，在含有多種雜質(zhì)的條件下，可選擇性擴(kuò)增細(xì)胞基因組中一個(gè)特定的DNA片段達(dá)數(shù)百萬(wàn)至數(shù)千萬(wàn)倍。,3. 轉(zhuǎn)基因(Transfers gene) 根據(jù)遺傳學(xué)原理,在體外合成含有突變序列的DNA片段,植入細(xì)胞染色體，通過(guò)制造定位定向轉(zhuǎn)基因改變哺乳動(dòng)物的基因型以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物。 4. 基因敲除(gene knockout) 基因敲除是80年代初出現(xiàn)的一項(xiàng)新的基因工程技術(shù)。 采用同源重組的方法,用體外合成的無(wú)效基因或突變基因取代相應(yīng)正?；?再應(yīng)用轉(zhuǎn)基因方法孵育出轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,即為基因敲除動(dòng)物。通過(guò)分析基因敲除動(dòng)物單基因缺陷來(lái)研究基因調(diào)控、基因功能、建立疾病模型、藥物作用及基因治療。,5. 生物芯片技術(shù)（biochi