1、dna的粗提取與鑒定,一、基礎(chǔ)知識(shí),（一）提取dna的方法,1、提取生物大分子的基本思路,選用一定的物理或化學(xué)方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子,2、提取dna的基本思路,利用dna與rna、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取dna，去除其他成分,3、dna的溶解性,dna和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的nacl溶液中溶解度不同，利用這一特點(diǎn)，選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使dna充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀，或者相反,根據(jù)dna在nacl溶液中的溶解度曲線(xiàn)圖，思考在什么濃度下，dna的溶解度最小？ dna在nacl溶液中的溶解度是如何變化的？,dna在nacl溶液中的溶解度曲線(xiàn)圖,在nac

2、l溶液濃度低于0.14 mol/l時(shí)，dna的溶解度隨nacl溶液濃度的增加而逐漸降低；在0.14 mol/l時(shí)，dna溶解度最小；當(dāng)nacl溶液濃度繼續(xù)增加時(shí)，dna的溶解度又逐漸增大。,如何通過(guò)控制nacl溶液的濃度使dna在鹽溶液中溶解或析出？,當(dāng)氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為 2 moll時(shí)，dna的溶解度最大，濃度為 014 moll時(shí)，dna的溶解度最低。利用這一原理，可以使dna在鹽溶液中溶解或析出。,dna不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些物質(zhì)則可以溶于酒精。利用這一原理，可以將dna與蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離,5、dna在酒精溶液中的溶解性,6、dna對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性,蛋白酶能水解蛋

3、白質(zhì)，但是對(duì)dna沒(méi)有影響,大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受6080的高溫，而dna在80以上才會(huì)變性,洗滌劑可以溶解細(xì)胞的細(xì)胞膜，去除脂質(zhì)和蛋白質(zhì),但對(duì)dna沒(méi)有影響,7、dna的鑒定,dna與二苯胺（沸水?。?huì)染成藍(lán)色，因此，二苯胺可以作為鑒定dna的試劑,二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),（一）實(shí)驗(yàn)材料的選取,1、材料：魚(yú)卵、豬肝、菜花、香蕉、雞血、哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜、在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌。（從中選取23種實(shí)驗(yàn)材料）,2、原則：凡是含有dna的生物材料都可以考慮，但選用dna含量相對(duì)較高的生物組織，成功的可能性更大,動(dòng)物細(xì)胞的破碎較易，例如，在雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水 ，同時(shí)用玻璃

4、棒攪拌，過(guò)濾后收集濾液即可,（二）破碎細(xì)胞，獲取含dna的濾液,1、動(dòng)物細(xì)胞,答：蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞來(lái)說(shuō)是一種低滲液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機(jī)械作用，就加速了雞血細(xì)胞的破裂(細(xì)胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出dna,討論：為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂？,植物細(xì)胞需要先用一定的洗滌劑和食鹽溶解細(xì)胞膜,2、植物細(xì)胞,討論：加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？,答：洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細(xì)胞膜，有利于dna的釋放；食鹽的主要成分是nacl，有利于dna的溶解,實(shí)例：提取洋蔥dna時(shí)，在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽，進(jìn)行從分的攪拌和研磨，過(guò)濾后收集研磨液,

5、答：研磨不充分會(huì)使細(xì)胞核內(nèi)的dna釋放不完全，提取的dna量變少，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等,討論：如果研磨不充分，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？,（三）去除濾液中的雜質(zhì),為了純化提取的dna需要將濾液作進(jìn)一步處理,討論：此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分？,答：可能含有核蛋白、多糖和rna等雜質(zhì),討論：方案二與方案三的原理有什么不同？,答：方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的dna與蛋白質(zhì)分開(kāi)；方案三利用的是dna和蛋白質(zhì)對(duì)高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與dna分離,（四） dna的析出與鑒定,dna的析出用的是與濾液體積相等的冷卻的酒精溶液

6、（體積分?jǐn)?shù)為95 ） ，靜置23min，溶液中會(huì)出現(xiàn)白色絲狀物，這就是粗提取dna。用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水,1、dna的析出,2、 dna的鑒定,鑒定dna時(shí)在試管中先加入物質(zhì)的量的濃度為2mol/l 的nacl溶液5ml于兩只試管中，其中一只加入dna絲狀物，各加入二苯胺4ml 試劑?；旌暇鶆蚝?，將試管置于沸水中加熱5min,待試管冷卻后，比較兩只試管中溶液顏色的變化，看看溶解有dna的溶液是否有藍(lán)色,雞血細(xì)胞液中dna的粗提取實(shí)驗(yàn)流程圖,2mol/l,雞血細(xì)胞液中dna的粗提取實(shí)驗(yàn)流程圖,5、過(guò)濾取紗布上的濾物,紗布過(guò)濾,6、再次溶解dna,2mol/ln

7、acl溶液,取濾物,雞血細(xì)胞液中dna的粗提取實(shí)驗(yàn)流程圖,7、加冷酒精使dna析出（純化）,冷酒精,雞血細(xì)胞液中dna的粗提取實(shí)驗(yàn)流程圖,dna的鑒定,總結(jié)：,加入檸檬酸鈉溶液的目的是防止血凝固,加速血細(xì)胞破裂,溶解dna,使2mol/l的nacl溶液稀釋至0.14mol/l使得dna最大限度地釋出,使含dna的黏稠物被留在紗布上,使含dna的黏稠物盡可能多的溶解于溶液中,除去含dna的濾液中的雜質(zhì),提取dna, a出現(xiàn)藍(lán)色 b無(wú)變化,dna的粗提取與鑒定,一、實(shí)驗(yàn)原理,1.血細(xì)胞在蒸餾水中會(huì)滲透吸水過(guò)度而導(dǎo)致細(xì)胞膜和細(xì)胞核膜的破裂。利用此特性可得到含有dna的溶液。,2.dna在氯化鈉溶液中

8、的溶解度，是隨著氯化鈉的濃度的變化而改變的。dna在物質(zhì)的量濃度為0.14 moll的氯化鈉溶液中的溶解度最低，利用這一原理，可以使溶解在氯化鈉溶液中的dna析出。,3.dna不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中的某些物質(zhì)則可以溶于酒精。利用這一原理，可以進(jìn)一步提取出含雜質(zhì)較少的dna。,4.dna遇二苯胺（沸水?。?huì)變成藍(lán)色，因此，二苯胺可以作為鑒定dna的試劑。,二、方法與過(guò)程,1.制雞血細(xì)胞液（活雞鮮血經(jīng)分離或沉淀獲得）,500ml燒杯中，玻棒攪拌，離心、分離或靜置沉淀。,2.提取dna,取血細(xì)胞5-10ml20ml蒸餾水，用玻棒沿一個(gè)方向快速攪拌。,紗布過(guò)濾：濾液中含dna和其他核物質(zhì)，如蛋白質(zhì)。

9、,原理：血細(xì)胞的細(xì)胞膜、核摸吸水脹破，玻璃棒快速攪拌，機(jī)械加速血細(xì)胞破裂。,.提取血細(xì)胞核物質(zhì)：,.溶解核內(nèi)的dna：,濾液2mol/l的nacl溶液40ml，玻棒沿一個(gè)方向輕緩攪拌。,.析出含dna的粘稠物：,.濾取含dna的粘稠物：,. dna粘稠物的再溶解：,在上述溶液中緩緩加入蒸餾水，并沿一個(gè)方向輕輕攪拌，出現(xiàn)絲狀物；當(dāng)絲狀物不在增加時(shí)，停止加水（此時(shí)nacl溶液的濃度相當(dāng)于0.14mol/l）。,用多層紗布過(guò)濾，含dna的粘稠物留在紗布上。,在20ml燒杯中輕緩攪拌3min，使盡可能多的dna溶解在nacl溶液。,.過(guò)濾含有dna的nacl溶液：,用放有兩層紗布的漏斗過(guò)濾步驟所得的溶

10、液，濾液中含有dna。,.提取含有雜質(zhì)較少的dna：,步驟所得的濾液體積分?jǐn)?shù)為95%的冷卻酒精50ml，用玻棒沿一個(gè)方向輕緩攪拌，溶液中（析出）出現(xiàn)乳白色絲狀物，用玻棒將絲狀物卷起，并用濾紙吸取上面的水分。,3.dna的鑒定：,加入二苯胺試劑4ml，用玻棒攪拌使dna溶解，沸水浴5min，觀察溶液是否出現(xiàn)藍(lán)色。,1.共有“三次過(guò)濾，兩次析出，七次攪拌”,2.加入“兩次蒸餾水，三次nacl溶液，一次酒精”,三、實(shí)驗(yàn)小結(jié),練習(xí),1、請(qǐng)解釋提取dna的實(shí)驗(yàn)操作中主要的步驟的目的。,答：提取dna的第一步是材料的選取，其目的是一定要選取dna含量較高的生物材料，否則會(huì)由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中或多或少的損失而造成

11、檢測(cè)的困難；第二步是dna的釋放和溶解，這一步是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵，要盡可能使細(xì)胞內(nèi)的dna全部溶解；第三步是dna的純化，即根據(jù)dna的溶解特性、對(duì)酶及高溫的耐受性的不同等特性，最大限度地將dna與雜質(zhì)分開(kāi)；最后一步是對(duì)dna進(jìn)行鑒定，這是對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的檢測(cè)。,2、你認(rèn)為從細(xì)胞中提取某種特定的蛋白質(zhì)與提取dna一樣容易嗎？,答：提取蛋白質(zhì)比提取dna的難度大。這是因?yàn)?，與dna相比，蛋白質(zhì)對(duì)溫度、鹽濃度、ph等條件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)多種多樣，理化性質(zhì)各不相同，使得蛋白質(zhì)的提取沒(méi)有一種統(tǒng)一的方法，只能根據(jù)特定蛋白質(zhì)的特性摸索提取的條件，設(shè)計(jì)特定的方法。,2.實(shí)驗(yàn)中nacl的物質(zhì)的量濃度為2 moll和0.14 moll對(duì)dna有何影響?,1.在dna的粗提取實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，兩次向燒杯中加入蒸餾水的作用是( )。 a.稀釋血液、沖洗樣品 b.使血細(xì)胞破裂、降低nacl濃度使dna析出 c.使血細(xì)胞破裂、增大dn