1、第十六章 基因診斷Gene Diagnosis,基因診斷以DNA或RNA為診斷材料，通過檢查基因的存在、缺陷或表達(dá)異常，對人體狀態(tài)和疾病作出診斷的方法和過程,第一節(jié) 基因診斷的技術(shù)方法,一、基因診斷中常用的分子生物學(xué)方法, 核酸分子雜交 PCR SSCP（PCR-SSCP） 限制酶酶譜分析 DNA序列測定 DNA芯片技術(shù), 核酸分子雜交,制備樣品,制備探針,雜交,檢測,獲得滿意的高特異性雜交的關(guān)鍵是控制好雜交條件和雜交后沖洗條件,雜交雙鏈的穩(wěn)定程度主要由Tm值決定，影響Tm值的因素包括： 雙鏈的堿基組成、長度、堿基錯配程度 溶液離子強(qiáng)度 變性劑的影響 在無變性劑存在的情況下，最適雜交發(fā)生在比D

2、NA/DNA Tm低2025，比DNA/RNA Tm低1015, PCR 一般與其它技術(shù)合用 單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）檢測 PCR- SSCP 由于檢測點(diǎn)突變, 限制酶酶譜分析 基因突變導(dǎo)致酶切位點(diǎn)的丟失或相對位置發(fā)生改變 DNA序列測定 DNA芯片技術(shù),二、基因診斷的基本方法,基因變異致病的類型： 內(nèi)源基因的變異 基因結(jié)構(gòu)的突變 點(diǎn)突變、插入、缺失、重排、異位 基因表達(dá)異常 mRNA剪接異常 外源基因的插入,基因突變的診斷,點(diǎn)突變的診斷 診斷已知的點(diǎn)突變 （PCR/ASO） 一對探針 突變堿基置探針中央 控制雜交條件 結(jié)果分析： 反向雜交技術(shù) 基因芯片技術(shù)：可檢測出新的突變類型,診斷未知的

3、突變 PCR/SSCP/測序 DNA芯片技術(shù),針對不同的點(diǎn)突變可采用的方法,PCR和限制酶酶解 PCR/ASOH 等位基因特異的PCR 變性梯度凝膠電泳 PCR/SSCP PCR/雙脫氧指紋法（DDF） PCR/測序,少數(shù)核苷酸缺失或插入的診斷 大片段丟失或插入的診斷 PCR/多重PCR 基因重排（染色體易位）的診斷 基因擴(kuò)增的診斷,多態(tài)性連鎖分析,DNA多態(tài)性在同種生物不同個體的基因組中，常存在一些不影響基因功能的DNA順序變異，稱為DNA多態(tài)性（polymorphism）,DNA多態(tài)性標(biāo)記 RFLP 短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandom repeat, STR） 單核苷酸多態(tài)性（sin

4、gle nucleotide polymorphism, SNP）,限制性片段長度多態(tài)性（RFLP） DNA酶切Southern雜交分析 DNAPCR 酶切電泳分析 由串聯(lián)重復(fù)順序?qū)е碌拈L度多態(tài)性 STR含有較高的信息量且容易檢測 STR由26個核苷酸串聯(lián)重復(fù)組成，微衛(wèi)星DNA,基因表達(dá)異常的診斷,mRNA的相對定量分析 斑點(diǎn)雜交或狹縫雜交 RTPCR mRNA的絕對定量分析 RTPCR/競爭性PCR mRNA長度分析 Northern雜交/ RTPCR產(chǎn)物電泳, 外源DNA檢測,核酸分子雜交 PCR技術(shù),第二節(jié) 遺傳病的基因診斷,一、遺傳性疾病基因診斷的策略,直接診斷 點(diǎn)突變 間接診斷 多態(tài)

5、性連鎖分析,鐮刀型紅細(xì)胞貧血癥： 第六位密碼由GAG突變成GTG,第三節(jié) 感染性疾病的基因診斷,一、感染性疾病基因診斷的策略,針對病原體特異的核酸序列設(shè)計探針進(jìn)行雜交 應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增病原體基因保守序列 核酸雜交技術(shù)與PCR技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用,第四節(jié) 腫瘤的基因診斷,一、腫瘤基因診斷的策略,檢測腫瘤相關(guān)基因 癌基因、抑癌基因、腫瘤轉(zhuǎn)移基因 檢測腫瘤相關(guān)病毒的基因 鼻咽癌EB，宮頸癌HPV 檢測腫瘤標(biāo)志物基因或mRNA 肝癌甲胎蛋白（AFP） 結(jié)腸癌癌胚抗原（CEA）,二、腫瘤相關(guān)基因的檢測,ras癌基因的檢測 ras基因中最常見的點(diǎn)突變是第12，13或61密碼子突變 檢測方法： PCR/ASO PCR-SSCP, p53的檢測 p53基因突變主要為點(diǎn)突變，熱點(diǎn)區(qū)域位于密碼子130290 檢測方法： PCR