1、第八章 抗體酶 核酶 極端酶,第一節(jié) 抗體酶（Abzyme),一、抗體酶的理論基礎(chǔ) 抗體蛋白的特性： 抗體（antibody）： 抗原（antigen）： 半抗原（hapten）：,IgG的三級(jí)結(jié)構(gòu),IgG與抗原形成 的交聯(lián)晶格,抗體與酶的異同： 相同點(diǎn)：都是蛋白質(zhì)，都有特異性。 不同點(diǎn)： 1）抗體無(wú)催化活力，酶有催化活力。 2）本質(zhì)差別：酶是能與反應(yīng)過(guò)渡態(tài)選擇結(jié)合的催化物質(zhì)，抗體是和基態(tài)緊密結(jié)合的物質(zhì)。 3）酶的活性和合成受到代謝調(diào)節(jié)，種類(lèi)有限。 抗體只有在抗原存在時(shí)才產(chǎn)生，種類(lèi)無(wú)限。,2.酶與底物形成過(guò)渡態(tài)理論 酶的催化在于能結(jié)合底物產(chǎn)生過(guò)渡態(tài)，降低能障（反應(yīng)的活化能）。 以過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物作

2、為半抗原，誘導(dǎo)與其互補(bǔ)構(gòu)象的抗體，使其具有催化活性，可觀察到抗體催化相應(yīng)底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。,二、抗體酶的定義 抗體酶又稱(chēng)催化抗體（catalytic antibody），是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結(jié)合的產(chǎn)物，本質(zhì)上是一類(lèi)具有催化活力的免疫球蛋白，在其可變區(qū)賦予了酶的屬性。,三、抗體酶的制備 1. 誘導(dǎo)法 用設(shè)計(jì)好的半抗原，通過(guò)與載體蛋白（如牛血清白蛋白）偶聯(lián)制成抗原。然后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫，取免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞雜交，雜交細(xì)胞則分泌單克隆抗體，經(jīng)篩選和純化，得抗體酶。,2. 拷貝法 用酶作為抗原免疫動(dòng)物得到抗酶的抗體，再將此抗體免疫動(dòng)物并進(jìn)行單克隆化，獲得單克隆的抗抗體。對(duì)抗

3、抗體進(jìn)行篩選，獲得具有原來(lái)酶活性的抗體酶。,四、抗體酶的應(yīng)用 1.戒毒: 用可卡因水解的過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物-磷酸單酯為半抗原，產(chǎn)生的單克隆抗體能催化可卡因的分解，水解后的可卡因片斷失去可卡因刺激功能。,2. 腫瘤治療 抗體介導(dǎo)前藥治療技術(shù):將能水解前藥釋放出腫瘤細(xì)胞毒劑的酶和腫瘤專(zhuān)一性抗體相偶聯(lián)，則酶通過(guò)和腫瘤結(jié)合的抗體存在于細(xì)胞的表面。靜脈給藥后，當(dāng)藥物擴(kuò)散至腫瘤細(xì)胞的表面或附近，抗體酶將前藥迅速水解釋放出抗腫瘤藥物。,第二節(jié) 核 酶（Ribozyme),一、核酶的概念 二、核酶的種類(lèi) 三、核酶的應(yīng)用 四、核酶面臨的問(wèn)題 五、影響核酶活性的因素,具有生物催化功能的RNA。,一、核酶的概念,克隆酶

4、遺傳修飾酶 蛋白質(zhì)工程新酶 、,Ribozyme,Deoxyribozyme,I型內(nèi)含子 剪接型核酶 II型內(nèi)含子 錘頭核酶 剪切型核酶 發(fā)夾核酶 自體催化 丁型肝炎病毒（HDV)核酶 RNaseP 異體催化,二、核酶的分類(lèi),1.剪接型核酶,剪接型核酶的作用機(jī)制是通過(guò)既剪又接的方式除去內(nèi)含子（Intron)。,1）I類(lèi)內(nèi)含子的自我剪接(Self-splicing),I型IVS是與四膜蟲(chóng)26srRNA前體的IVS結(jié)構(gòu)相似的間隔序列，具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)。通過(guò)轉(zhuǎn)磷酸酯反應(yīng)，生成成熟的26srRNA及G-IVS，G-IVS經(jīng)兩次環(huán)化生成L-19IVS。催化過(guò)程需要鳥(niǎo)苷酸或鳥(niǎo)苷以及鎂離子參與。 剪接機(jī)制 L-

5、19IVS在體外的多種酶活性,p,3 HO-G,p,3,p,P-G,OH,p,P-G,3 HO,類(lèi)內(nèi)含子的剪接機(jī)制,Mg 2+或Mn 2+,GMP,GDP,GTP,外顯子,內(nèi)含子或居間序列（Intervening sequence,IVS),5,UCUAAA,IVS,GUAA,Pre-rRNA,UCU,A A A,GUAA,UCUoH3,5GAAA,GUAA,UCUUAA,5GAAA,GOH 3 G-IVS,L-19IVS,19nt,5,3,rRNA,5,3,5,pGOH,3,5,3,四膜蟲(chóng)rRNA前體自我剪接反應(yīng),1、轉(zhuǎn)核苷酸作用 2CpCpCpCpC CpCpCpCpCpC +CpCpCp

6、C 2、水解作用 CpCpCpCpC CpCpCpC + pC 3、轉(zhuǎn)磷酸作用 CpCpCpCpCpCp+UpCpU CpCpCpCpCpC + UpCpUp 4、去磷酸作用 CpCpCpCpCp CpCpCpCpC +Pi 5、限制性?xún)?nèi)切酶作用 CpUpCpUpN +G CpUpCpU +GpN,2）類(lèi)內(nèi)含子的自我剪接,型IVS是與細(xì)胞核mRNA前體的IVS結(jié)構(gòu)相似的間隔序列。通過(guò)轉(zhuǎn)磷酸酯反應(yīng)，生成成熟的RNA及套環(huán)狀的IVS。催化的剪接反應(yīng)不需要鳥(niǎo)苷或鳥(niǎo)苷酸參加，但仍需要鎂離子(Mg2+)。 剪接機(jī)制,p,2 HO-A,p,p-A,p,3 OH,p,P-A,HO 3,類(lèi)內(nèi)含子的剪接機(jī)制,M

7、g 2+,套環(huán)的形成,5,3,外顯子連接,2.剪切型核酶 這類(lèi)RNA進(jìn)行自身催化的反應(yīng)是只切不接。1）自體催化剪切型 剪切機(jī)制,轉(zhuǎn)酯化過(guò)程： 由靠近切割位點(diǎn)3端的2OH或氧原子對(duì)切割位點(diǎn)的磷原子實(shí)施親核攻擊，產(chǎn)生5-OH 和2，3-環(huán)磷酸二酯。,剪 切 機(jī) 制,核酶自身剪切反應(yīng),錘頭型核酶的二級(jí)結(jié)構(gòu) 和空間立體結(jié)構(gòu)示意圖,三個(gè)雙螺旋區(qū)。 13個(gè)核苷酸殘基保守序列。 剪切反應(yīng)在右上方GUX序列的3端自動(dòng)發(fā)生。,發(fā)夾（hairpin ）結(jié)構(gòu),1989年漢普（Hample）研究煙草環(huán)斑病毒（sTRSV）的負(fù)鏈RNA的自我剪切反應(yīng)，提出發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin structure）模型。 發(fā)夾核酶結(jié)構(gòu)

8、模型,四個(gè)螺旋區(qū)、三個(gè)連接區(qū)和兩個(gè)環(huán)。 剪切反應(yīng)發(fā)生在底物識(shí)別序列GUC的5端。,5,3,發(fā)夾二級(jí)結(jié)構(gòu)模型,剪切位點(diǎn),2) 異體催化剪切型 核糖核酸酶P(RNaseP)是內(nèi)切核酸酶，是核糖核蛋白體復(fù)合物，能剪切所有tRNA前體的5端，除去多余的序列，形成3-OH 和 5-磷酸末端。 RNaseP由M1RNA和蛋白質(zhì)亞基組成。,三、核酶的應(yīng)用,1. 基礎(chǔ)理論：生命起源的探索 2. 醫(yī)藥： 1）通過(guò)識(shí)別特定位點(diǎn)而抑制目標(biāo)基因的表達(dá)，抑制效率高，專(zhuān)一性強(qiáng)。如抗肝炎病毒、抗人類(lèi)免疫缺陷病毒型（HIV- )、抗腫瘤。 2）免疫原性低，很少引起免疫反應(yīng)。 3. 植物抗病毒,四、核酶面臨的問(wèn)題,1、核酶催化

9、效率低。 2、核酶本身是RNA，很容易被核酸水解酶 RNase破壞。,五、影響核酶活性的因素,1、pH值對(duì)活性的影響： pH7.0- 7.5時(shí)核酶活性最高。 2、二價(jià)金屬陽(yáng)離子對(duì)活性的影響: Mg2+ Mn2+ 3、抗生素對(duì)活性的影響：大多數(shù)為抑制效應(yīng) 4、變性劑對(duì)活性的影響: 5、溫度對(duì)活性的影響:,第三節(jié) 極端酶（extremozyme） 一、極端微生物和極端酶 1.極端微生物： 又稱(chēng)嗜極菌（extremophiles），是在超常生態(tài)環(huán)境條件下生存的微生物。,根據(jù)所耐受的環(huán)境條件不同，分為： 嗜熱菌（thermophiles） 超嗜熱菌（hyperthermophiles） 嗜冷菌（psychrophiles） 嗜鹽菌（halophiles） 嗜酸菌（acidophiles） 嗜堿菌（al