1、.,蛋白質(zhì)的變性、凝固及沉淀,實(shí)驗(yàn)一,生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,.,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?能夠說(shuō)出蛋白質(zhì)變性、凝固反應(yīng)的原理及實(shí)驗(yàn)方法 能夠說(shuō)出蛋白質(zhì)沉淀反應(yīng)的原理及實(shí)驗(yàn)方法 能夠運(yùn)用鹽析法及重金屬沉淀法,.,主要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,蛋白質(zhì)的加熱變性凝固 蛋白質(zhì)沉淀反應(yīng) 蛋白質(zhì)鹽析 重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì) 生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì),.,蛋白質(zhì)的變性 (denaturation),在某些理化因素的作用下，蛋白質(zhì)嚴(yán)格的空間結(jié)構(gòu)被破壞（不包括肽鍵的斷裂），從而引起若干理化性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)改變的現(xiàn)象。,.,變性后的蛋白質(zhì)稱變性蛋白,能使蛋白質(zhì)變性的物質(zhì)叫蛋白質(zhì)變性劑。,變性因素,物理因素,高溫、高壓,紫外線、X射線、,電離輻射和

2、超聲波等,化學(xué)因素,強(qiáng)酸、強(qiáng)堿,有機(jī)溶劑、重金屬鹽,高濃度尿素、鹽酸胍等,變性實(shí)質(zhì)：,破壞了空間結(jié)構(gòu)，一級(jí)結(jié)構(gòu)不受影響（分子組成、 分子量不變）。,.,變性的可逆性,可逆變性：除去變性因素，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)可以恢復(fù)原狀。 不可逆變性：除去變性因素，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)不能恢復(fù)原狀。,.,蛋白質(zhì)分子顆粒大小1-100nm之間,屬膠體顆粒范圍，在溶液中能形成穩(wěn)定的膠體。,原因,蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)及沉淀:,表面形成水化層,表面同種電荷的斥力,除去這兩個(gè)因素，就會(huì)發(fā)生沉淀。蛋白質(zhì)分子相互聚集而從溶液中析出的現(xiàn)象稱為沉淀。,+,+,+,+,+,+,+,+,.,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+

3、,+,+,-,-,-,-,-,-,-,-,蛋白質(zhì)膠體顆粒的沉淀,帶正電荷的蛋白質(zhì),帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì),在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì),酸,酸,堿,堿,脫水,脫水,脫水,不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒 （沉淀）,帶正電荷的蛋白質(zhì) （疏水膠體）,帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì) （疏水膠體）,堿,酸,（親水膠體）,（親水膠體）,（親水膠體）,-,-,-,-,-,-,-,-,.,可逆沉淀,不可逆沉淀,結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都不變,適當(dāng)條件下可重新溶解,是分離和純化的基本方法,結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都發(fā)生變化,沉淀不再溶解于水,蛋白質(zhì)的沉淀,.,蛋白質(zhì)變性沉淀并凝聚成塊狀稱為凝固。 不可逆變性狀態(tài),蛋白質(zhì)的凝固,.,蛋白質(zhì)變性、沉淀與凝固的關(guān)系,變性屬于蛋白質(zhì)本質(zhì)的變

4、化，沉淀和凝固屬于一種現(xiàn)象 變性不一定沉淀，變性蛋白質(zhì)只在等電點(diǎn)附近才沉淀 變性蛋白易于沉淀， 沉淀蛋白不一定變性 沉淀的變性蛋白質(zhì)也不一定凝固,.,蛋白質(zhì)的加熱變性凝固,蛋白質(zhì)分子受熱作用，分子空間結(jié)構(gòu)變化，疏水基團(tuán)暴露于分子表面，溶解度降低。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子不帶電荷（處于等電點(diǎn)條件下），則蛋白質(zhì)發(fā)生聚集出現(xiàn)沉淀； 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子帶電（處于非等電點(diǎn)條件下），則蛋白質(zhì)因靜電排斥作用而不出現(xiàn)沉淀；,.,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,取三只小玻璃試管，各加入10%蛋白質(zhì)溶液10d，分別標(biāo)記為1、2和3號(hào)管； 向1號(hào)管中加入：pH4.8緩沖液10d ?；靹?，于酒精燈上緩慢加熱至沸點(diǎn)，觀察變化（ ）；,高溫下，蛋白質(zhì)發(fā)生不可

5、逆的變性并凝固。,.,向2號(hào)管中加入：H2O 8d, 0.1mol/L HCl 2d。混勻，于酒精燈上緩慢加熱至沸點(diǎn)，觀察變化（ ） 停止加熱，向2號(hào)管中逐滴加入：0.1mol/L NaCO3 。搖勻后繼續(xù)滴加，一旦出現(xiàn)絮狀物即停止。 將2號(hào)管于酒精燈上加熱，觀察現(xiàn)象（ ） 冷卻后，再加入： 0.1mol/L HCl 2d。觀察現(xiàn)象（ ）,蛋白質(zhì)變性不一定出現(xiàn)沉淀； 蛋白質(zhì)變性后在特定條件下發(fā)生沉淀； 沉淀加熱后發(fā)生不可逆變性并凝固。,.,向3號(hào)管中加入：H2O 8d, 0.1mol/L NaOH 2d?；靹?，于酒精燈上緩慢加熱至沸點(diǎn)，觀察變化（ ）； 停止加熱，向3號(hào)管中逐滴加入：0.1mo

6、l/L HAC。一旦出現(xiàn)絮狀物即停止。 繼續(xù)滴加：0.1mol/L HAC 1d。觀察現(xiàn)象（ ） 將3號(hào)管于酒精燈上加熱，觀察現(xiàn)象（ ） 向3號(hào)管中加入： 0.1mol/L NaOH 。一旦出現(xiàn)絮狀物即停止。 將3號(hào)管于酒精燈上加熱，觀察現(xiàn)象（ ） 冷卻后，再加入： 0.1mol/L NaOH 2d。觀察現(xiàn)象（ ）,蛋白質(zhì)變性不一定出現(xiàn)沉淀； 蛋白質(zhì)變性后在特定條件下發(fā)生沉淀，并可逆；,.,蛋白質(zhì)沉淀反應(yīng),蛋白質(zhì)的鹽析 一定濃度中性鹽 （ (NH4)2SO4、Na2SO4等）可去除蛋白質(zhì)分子所帶電荷及其表面的水化層，從而使蛋白質(zhì)從溶液中聚集沉淀出來(lái)。利用這個(gè)原理使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀出來(lái)的方法為

7、鹽析。 不同蛋白質(zhì)鹽析時(shí)所需的鹽濃度不同，可以通過(guò)不同濃度鹽溶液分離不同蛋白質(zhì)，就是分段鹽析。 大部分蛋白質(zhì)都可用飽和(NH4)2SO4溶液鹽析出來(lái)。 某些蛋白質(zhì)在半飽和(NH4)2SO4溶液中析出。 鹽析是一個(gè)可逆沉淀反應(yīng)。,.,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,取一只小玻璃試管，加入2mL蛋白質(zhì)溶液； 加入等體積飽和(NH4)2SO4溶液，混勻后靜置3min。觀察現(xiàn)象（ ） 對(duì)該溶液進(jìn)行過(guò)濾，將濾液收集于一只干凈試管中，取部分轉(zhuǎn)入另一只試管中； 向一只試管中加入結(jié)晶(NH4)2SO4粉末，直到粉末不再溶解（成為飽和(NH4)2SO4溶液）； 比較兩只試管現(xiàn)象（ ）,.,蛋白質(zhì)沉淀反應(yīng),重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì) 在堿性條件下，重金屬離子與蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶性蛋白鹽而沉淀。,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,取一只小玻璃試管，加入1mL蛋白質(zhì)溶液； 加入0.1mol/mL NaOH 2d，混勻； 逐滴加入CuSO4，搖勻，直至出現(xiàn)沉淀為止。,.,蛋白質(zhì)沉淀反應(yīng),生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì) 在酸性條件下，蛋白質(zhì)可與生物堿試劑(如苦味酸、鎢酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、過(guò)氯酸、硝酸)結(jié)合成不溶性的鹽沉淀，此時(shí)蛋白質(zhì)帶正電荷易于與酸根負(fù)離子結(jié)合成鹽。,