1、第10章 吸光光度法,10.1 概述 10.2 吸光光度法基本原理 10.3 分光光度計 10.4 顯色反應及影響因素 10.5 光度分析法的設計 10.6 吸光光度法的誤差 10.7 常用的吸光光度法 10.8 吸光光度法的應用,吸光光度法：分子光譜分析法的一種，又稱分光光度法，屬于分子吸收光譜分析方法 基于外層電子躍遷,10.1 概述,吸收光譜 發(fā)射光譜 散射光譜,分子光譜 原子光譜,10.2 吸光光度法基本原理,1 吸收光譜產生的原因 光:一種電磁波,波粒二象性,當光子的能量與分子的E匹配時，就會吸收光子 E=hu=hc/l,a 躍遷類型 價電子躍遷：*, *; n*, n* E (h)

2、 順序: n* n*,有機化合物的生色原理,b 生色團和助色團 生色團: 含有*躍遷的不飽和基團 助色團: 含非鍵電子的雜原子基團,如-NH2, -OH, -CH3 與生色團相連時，會使吸收峰紅移，吸收強度增強,2 物質顏色和其吸收光關系,互補色,吸收光譜曲線：物質在不同波長下吸收光的強度大小 Al關系 最大吸收波長 lmax：光吸收最大處的波長,3 一些基本名詞和概念,lmax,對比度(l):絡合物最大吸收波長(lMRmax)與試劑最大吸收波(lRmax)之差,l,原子光譜為線光譜 分子光譜為帶光譜,電子躍遷能級 分子振動能級 分子轉動能級,4 朗伯-比爾定律,光吸收定律朗伯-比爾(Lamb

3、ert-Beer)定律 吸光光度法的理論依據，研究光吸收的最基本定律,I0 = Ir + It + Ia,I0 = It + Ia,T = It / I0 , T: 透射比或透光度 A=lg (I0 / It )lg(1/T), A:吸光度,朗伯定律（1760年）：光吸收與溶液層厚度成正比 比爾定律（1852年）：光吸收與溶液濃度成正比,當一束平行單色光垂直照射到樣品溶液時，溶液的吸光度與溶液的濃度及光程（溶液的厚度）成正比關系朗伯比爾定律 光吸收定律 數學表達：Alg(1/T)=Kbc 其中，A:吸光度，T:透射比， K:比例常數，b:溶液厚度，c:溶液濃度,注意： 平行單色光 均相介質 無

4、發(fā)射、散射或光化學反應,摩爾吸光系數 e,靈敏度表示方法,A = e bc,A = Kbc,c: mol/L,e 表示物質的濃度為1mol/L,液層厚度為1cm時溶液的吸光度。單位： (Lmol-1 cm-1),c: g/L,A = abc a: 吸光系數,桑德爾(Sandell)靈敏度： S 當儀器檢測吸光度為0.001時，單位截面積光程內所能檢測到的吸光物質的最低含量。 單位：mg/cm2 S=M/e,吸光度的加和性,A1 = e1bc1 A2 = e2bc2 A = e1bc1+ e2bc2,根據吸光度的加和性可以進行多組分的測定以及某些化學反應平衡常數的測定,在某一波長，溶液中含有對該

5、波長的光產生吸收的多種物質，那么溶液的總吸光度等于溶液中各個吸光物質的吸光度之和,1 分光光度計的組成,10.3 吸光光度計,常用光源,單色器 作用:產生單色光 常用的單色器：棱鏡和光柵,樣品池（比色皿） 厚度(光程): 0.5, 1, 2, 3, 5cm 材質：玻璃比色皿可見光區(qū) 石英比色皿可見、紫外光區(qū),檢測器 作用：接收透射光，并將光信號轉化為電信號 常用檢測器： 光電管 光電倍增管 光二極管陣列,光電管分為紅敏和紫敏，陰極表面涂銀和氧化銫為紅敏，適用6251000nm波長；陰極表面涂銻和銫為紫敏，適用200625nm波長,目視比色法比色管,光電比色法光電比色計 光源、濾光片、比色池、硒

6、光電池、檢流計,分光光度法與分光光度計,722型分光光度計光學系統(tǒng)圖,1.光源；2.濾光片；3,8聚光鏡4,7.狹縫；5.準直鏡；6.光柵 9.比色池；10.光電管,10.4 顯色反應及影響因素,要求： a. 選擇性好 b. 靈敏度高 (104) c. 產物的化學組成穩(wěn)定 d. 化學性質穩(wěn)定 e. 反應和產物有明顯的顏色差別 (l60nm),沒有顏色的化合物，需要通過適當的反應定量生成有色化合物再測定 顯色反應,1 顯色反應,絡合反應,氧化還原反應,2 顯色反應類型,離子締合反應,成鹽反應,褪色反應 Zr(IV)-偶氮胂III絡合物測定草酸,吸附顯色反應 達旦黃測定Mg(II),Mg(OH)2

7、吸附達旦黃呈紅色,3 顯色劑,無機顯色劑: 過氧化氫，硫氰酸銨，碘化鉀,有機顯色劑： 偶氮類：偶氮胂III,三苯甲烷類 三苯甲烷酸性染料 鉻天菁S,三苯甲烷堿性染料 結晶紫,鄰菲羅啉類：新亞銅靈,肟類：丁二肟,4 多元絡合物,混配化合物 Nb-5-Br-PADAP-酒石酸 V-PAR-H2O 離子締合物 AuCl4-羅丹明B 金屬離子-配體-表面活性劑體系 Mo-水楊基熒光酮-CTMAB,5 影響因素,a 溶液酸度（pH值及緩沖溶液） 影響顯色劑的平衡濃度及顏色，改變l 影響待測離子的存在狀態(tài)，防止沉淀 影響絡合物組成,pH對苯芴酮及其絡合物的顏色影響,b 顯色劑的用量,稍過量，處于平臺區(qū),c

8、 顯色反應時間,針對不同顯色反應確定顯示時間 顯色反應快且穩(wěn)定；顯色反應快但不穩(wěn)定； 顯色反應慢，穩(wěn)定需時間；顯色反應慢但不穩(wěn)定,d 顯色反應溫度,加熱可加快反應速度，導致顯色劑或產物分解,e 溶劑,f 干擾離子,有機溶劑，提高靈敏度、顯色反應速率,消除辦法： 提高酸度，加入隱蔽劑，改變價態(tài) 選擇合適參比 褪色空白(鉻天菁S測Al，氟化銨褪色，消除鋯、鎳、鈷干擾) 選擇適當波長,10.5 光度分析法的設計,1. 選擇顯色反應 2. 選擇顯色劑 3. 優(yōu)化顯色反應條件 4. 選擇檢測波長 5. 選擇合適的濃度 6. 選擇參比溶液 7. 建立標準曲線,測量條件選擇,1 測定波長選擇,選擇原則：“吸

9、收最大，干擾最小”,靈敏度,選擇性,2 測定濃度控制,控制濃度 吸光度A：0.20.8,減少測量誤差,3 參比溶液選擇,儀器調零 消除吸收池壁和溶液對入射光的反射 扣除干擾,試劑空白 試樣空白 褪色空白,4 標準曲線制作,理論基礎：朗伯-比爾定律,相同條件下 測定不同濃度標準溶液的吸光度A Ac 作圖,10.6 吸光光度法的誤差,非單色光引起的偏移 物理化學因素：非均勻介質及化學反應 吸光度測量的誤差,對朗伯-比爾定律的偏移,1 非單色光引起的偏移,復合光由l1和l2組成，對于濃度不同的溶液a和b,引起的吸光度的偏差不一樣，濃度大，復合光引起的誤差大，故在高濃度時線性關系向下彎曲。,非均勻介質

10、 膠體，懸浮、乳濁等對光產生散射，使實測吸光度增加，導致線性關系上彎,2 物理化學因素,離解、締合、異構等 如：Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H+2CrO42- PAR的偶氮醌腙式,化學反應,吸光度標尺刻度不均勻,3 吸光度測量的誤差,A0.434 ，T36. 8% 時，測量的相對誤差最小 A=0.20.8, T=1565%，相對誤差4%,dc/c= dA/A=dT/TlnT,Er=dc/c100= dA/A100=dT/TlnT100,1.示差吸光光度法 目的：提高光度分析的準確度和精密度 解決高(低)濃度組分(i.e. A在0.20.8以外)問題 分類：高吸光度差示法、低吸光

11、度差示法、 精密差示吸光度法 特點： 以標準溶液作空白 原理： A相對 = A = bcx- bc0= b c 準確度：讀數標尺擴展, 相對誤差減少, c0愈接近cx, 準確度提高愈顯著,10.7 常用的吸光光度法,例：硫脲還原硫氰酸鹽比色法測定鋼鐵中的鉬。酸溶，硫酸高氯酸介質中，硫脲還原鐵（III）為鐵(II),除干擾，還原鉬（VI）為五價，2.00mg/100ml的鉬標準溶液為參比溶液，用2.00-2.30mg/100ml的鉬標準溶液，繪制工作曲線和測定樣品溶液的吸光度,480nm測定A。,2.雙波長吸光光度法 目的：解決渾濁樣品光度分析 消除背景吸收的干擾 多組分同時檢測 原理： A =

12、 Al1-Al2 = （l1- l2）b c 波長對的選擇： a.等吸光度點法，b.系數倍率法,3.導數吸光光度法,目的：提高分辨率 去除背景干擾 原理： dnA/dln l,10.8 吸光光度法的應用,1 測定弱酸和弱堿的離解常數,AHB和AB-分別為有機弱酸HB在強酸和強堿性時的吸光度，它們此時分別全部以HB或B-形式存在。,HB H+ + B-,pKa=pH+ lg,HB,B-,A=AHB+AB-,對pH作圖即可求得pKa,2 絡合物組成確定,飽和法（摩爾比法）,制備一系列含釕3.010-5 mol/L (固定不變)和不同濃度（小于12.010-5 mol/L）的PDT溶液，按實驗條件，485nm測定吸光度,作圖。,PDT:Ru=2:1,等摩爾連續(xù)變化法,固定M+L,改變M,獲得一系列吸光度值，吸光度最