1、第四章 高效液相色譜 4.1 概述 4.2 HPLC儀器 包括： 高壓輸液裝置; 進樣系統(tǒng); 分離系統(tǒng); 檢測系統(tǒng);輔助系統(tǒng) 4.3 流動相和固定相簡介 4.4 高效液相色譜方法各論 分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜、尺寸排阻色譜和親和色譜 4.5 應(yīng)用注意事項,4.1 概述 高效液相色譜(HPLC)是以溶劑液體為流動相的色譜方法。按照固定相不同可分為：液液分配色譜；吸附色譜(液固色譜)；離子交換色譜；尺寸排阻色譜(凝膠滲透色譜)。此外，還有親和色譜、平板色譜(薄層色譜)等。 早期液相色譜，包括Tswett的工作，都是在直徑15cm, 長50500cm的玻璃柱中進行的。為保證有一定的柱流速，填

2、充的固定相顆粒直徑多在150200m范圍內(nèi)。即使這樣，流速仍然很低(1mL/min)，分析時間仍然很長！ 當加壓增加流速(真空或空氣泵)時，盡管分析時間減少，但柱塔板高度Hmin也相應(yīng)增加了！或者說柱效下降了。 為了解決分析時間及柱效問題，人們認識到：最為有效地增加柱效的唯一方法是減小填充物的粒徑（310 m ）！ 直到60年代，由于在高壓下操作的液壓設(shè)備、高效固定相以及高靈敏檢測器的出現(xiàn)及發(fā)展，才徹底解決了分析時間及柱效的問題。即所謂的高效液相色譜技術(shù)才真正得到廣泛應(yīng)用。,1. 高效液相色譜與經(jīng)典液相色譜方法的比較 高速：HPLC采用高壓輸液設(shè)備，流速大增加，分析速度極快，只需數(shù)分鐘；而經(jīng)典

3、方法靠重力加料，完成一次分析需時數(shù)小時。 高效：填充物顆粒極細且規(guī)則，固定相涂漬均勻、傳質(zhì)阻力小，因而柱效很高?？梢栽跀?shù)分鐘內(nèi)完成數(shù)百種物質(zhì)的分離。 高靈敏度：檢測器靈敏度極高：UV10-9g, 熒光檢測器10-11g。 2. HPLC與GC的比較 分析對象及范圍：GC分析只限于氣體和低沸點的穩(wěn)定化合物，而這些物質(zhì)只點有機物總數(shù)的20%；HPLC可以分析高沸點、高分子量的穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物，這類物質(zhì)占有機物總數(shù)的80%。 流動相的選擇：GC采用的流動相中為有限的幾種“惰性”氣體，只起運載作用，對組分作用??；HPLC采用的流動相為液體或各種液體的混合，可供選擇的機會多。它除了起運載作用外，還可與

4、組分作用，并與固定相對組分的作用產(chǎn)生競爭，即流動相對分離的貢獻很大，可通過溶劑來控制和改進分離。 操作溫度：GC需高溫；HPLC通常在室溫下進行。 結(jié)論：從色譜分析的發(fā)展來看，HPLC比GC更為有用、更具發(fā)展前途！,3. 應(yīng)用 由于HPLC分離分析的高靈敏度、定量的準確性、適于非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定組分的分析，因此，在工業(yè)、科學研究，尤其是在生物學和醫(yī)學等方面應(yīng)用極為廣泛。如氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸、烴、碳水化合物、藥品、多糖、高聚物、農(nóng)藥、抗生素、膽固醇、金屬有機物等分析，大多是通過HPLC來完成的。 右圖是各種HPLC方法的應(yīng)用范圍及對象,極性增加,不溶于水,溶于水,非極性,離子,非離子極性,吸附

5、,反向分配,分配,正向分配,離子交換,尺寸排阻,凝膠滲透,凝膠過濾,分 子 量,4.2 HPLC儀器 HPLC儀器包括： 高壓輸液裝置; 進樣系統(tǒng); 分離系統(tǒng); 檢測系統(tǒng); 此外還配有梯度淋洗、自動進樣和數(shù)據(jù)處理裝置。 其工作過程如圖所示。,HPLC儀器詳解,1. 高壓輸液系統(tǒng) 1）貯液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶劑過濾器(Ni合金)，其孔很約2 m，可防止顆粒物進入泵內(nèi)。 2）脫氣：超聲波脫氣或真空加熱脫氣。溶劑通過脫氣器中的脫氣膜，相對分子量小的氣體透過膜從溶劑中除去（氣泡會影響檢測）。 3）高壓泵： 對輸液泵的要求：密封性好、輸液流量穩(wěn)定無脈動、可調(diào)范圍寬、耐腐蝕。 輸液泵種類：恒壓型和

6、恒流型。 恒壓泵(類似于風箱)可迅速獲得高壓，適于柱的勻漿填充。但因泵腔體積大，在往復(fù)推動時，會引起脈動，且輸出流量隨色譜系統(tǒng)阻力（主要是柱填充物）變化而變化，現(xiàn)已較少使用。 恒流型溶劑流量恒定，與柱填充情況無關(guān)，使用較多。有機械注射式和機械往復(fù)式兩種。應(yīng)用最多的是機械往復(fù)式恒流泵(見下圖。每分鐘往復(fù)25100次，因此脈動小。對流量變化敏感的檢測器也會有噪聲干擾，此時可連接一脈動阻尼器)。,4）梯度淋洗裝置：在分離過程中逐漸改變流動相組成的裝置。如果只有一個泵，可采用低壓混合設(shè)計（將兩種或以上的溶劑按一定比例混合，再由高壓泵輸出）；如果有兩個或以上泵，調(diào)節(jié)各自的流量，在高壓下混合。,2. 進樣

7、系統(tǒng) 與GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所產(chǎn)生的峰形展寬相對要小些。即，HPLC的展寬多因一些柱外因素引起。這些因素包括：進樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器的死體積。進樣裝置包括兩種。 1）隔膜注射進樣：使用微量注射器進樣。裝置簡單、死體積小。但進樣量小且重現(xiàn)性差。 2）高壓進樣閥：目前最常用的為六通閥。由于進樣量可由樣品管控制，因此進樣準確，重復(fù)性好，如圖。,3. 色譜柱 1）對色譜柱的要求：內(nèi)壁光滑的優(yōu)質(zhì)不銹鋼柱，柱接頭的死體積盡可能小。柱長多為1030cm，內(nèi)徑為45mm(尺寸排阻色譜柱常大于5mm，制備色譜柱內(nèi)徑更大)； 2）柱的填充：主要采用勻漿法。根據(jù)使用勻漿試劑的性質(zhì)不同可分

8、為： 平衡密度法： 使溶劑密度和填充顆粒密度相近，此時顆粒沉降速度趨于0。常用的勻漿試劑有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等； 非平衡密度法： 采用粘度較大的試劑，如CCl4，CH3OH, 丙酮，二氧雜環(huán)已烷、THF等。 填充方法： 填充時，按上述方法制作勻漿液，用流動相充滿色譜柱及其延長管中，然后將勻漿液倒入勻漿填充器，在較高壓力下迅速將其注入色譜柱內(nèi)。要求填充速度快(防凝聚、沉降或結(jié)塊)、且無空氣進入(影響填充均勻性)。,4. 檢測系統(tǒng),檢測器 液相色譜檢測器包括紫外吸收、熒光發(fā)射、示差折光和安培檢測器等。 1）紫外檢測器 其檢測原理和UV-Vis方法一樣。只是此時所采用的吸收池為微量吸收池，

9、通常其光程為2-10mm, 體積約為110 L。 HPLC分析中，約有80%的物質(zhì)可以在254 nm或280nm處產(chǎn)生紫外吸收。因此該類檢測器應(yīng)用很廣。 在選擇測量波長時注意：溶劑必須能讓所選擇的光透過，即所選波長不能小于溶劑的最低使用波長。,快速掃描光電二極管陣列（PDA）檢測所獲得的三維色譜-光譜圖,4）安培檢測器 由恒電位儀和一薄層反應(yīng)池（體積為15L）組成。如圖。 該檢測器是利用待測物流入反應(yīng)池時在工作電極表面發(fā)生氧化或還原反應(yīng)，兩電極間就有電流通過，此電流大小與待測物濃度成正比。 采用安培檢測器時，流動相必須含有電解質(zhì)，且呈化學隋性。它最適于與反相色譜匹配。但此檢測器只能檢測具有電活

10、性的物質(zhì)。,5）電導(dǎo)檢測器 電導(dǎo)檢測器主要用于離子色譜的檢測。 其原理是基于待測物在一些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生的電導(dǎo)（電阻的倒數(shù)）變化來測量電離物質(zhì)的含量。 電導(dǎo)檢測器的主要部件是電導(dǎo)池。其響應(yīng)受溫度影響較大，因此需要將電導(dǎo)池置于恒溫箱中。另外，當pH7時，該檢測器不夠靈敏。 其它檢測器還包括：MS、IR、Evaporative light scattering detector(光散射)、極譜等。,4.3 HPLC流動相和固定相簡介 一、流動相 與GC流動相不同，HPLC流動相為溶劑，它既有運載作用，又和固定相一樣，參予對組分的競爭，因此溶劑的選擇對分離十分重要。 理想的溶劑應(yīng)有下列特性： 1）

11、對待測物具一定極性和選擇性； 2）使用UV檢測器時，溶劑截止波長要小于測量波長(為什么？) ；使用折光率檢 測器，溶劑的折光率要與待測物的折光率有較大差別； 3）高純度。否則基線不穩(wěn)或產(chǎn)生雜峰，同時可使截止波長增加； 4）化學穩(wěn)定性好； 5）適宜的粘度。粘度過高，柱壓增加；過低，易產(chǎn)生氣泡。 二、固定相載體 由于各種HPLC分離方法的流動相均為液體，因此，HPLC通常是按照固定相載體或固定液的不同來分類的。,1. 按承受壓力分 剛性固體：SiO2為基質(zhì)，耐壓為7.01081.0109 Pa?？芍瞥芍睆健⑿螤詈涂紫?深度不同的顆粒；主要用于吸附、分配和鍵合色譜； 硬 膠：以聚合物為基質(zhì)(常用苯乙

12、烯與二乙烯苯交聯(lián)而成)，耐壓上限為3.5 108 Pa, 主要用于離子交換和尺寸排阻色譜。 2. 按孔隙深度分 表面多孔型：以實心玻璃珠為基體，在基體表面覆蓋一層多孔活性材料(如硅膠、 氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酰胺等)。表面多孔型固定相的 顆粒大(易裝柱)、多孔層厚度小且孔淺(滲透性好，出峰快)；但交 換容量小。適于常規(guī)分離分析。 全多孔型：全部由硅膠或氧化鋁微粒聚集而成，因顆粒極細，因而孔徑小、傳 質(zhì)快、 柱效高。特別適于復(fù)雜混合物的分離。 3. 按分離原理分： 分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜、尺寸排阻色譜和親和色譜等,4.4 高效液相色譜方法各論 按分離原理可將HPLC分為分配色譜

13、、吸附色譜、離子交換色譜、尺寸排阻色譜和親和色譜等。,一、吸附色譜的分離機理,隨著樣品在固定相上的吸附能力由大到小 在色譜柱上的保留由長到短,吸附色譜概述,分離基于樣品的極性差異。 洗脫次序一般為正相，即：極性低的先被洗脫 常用的流動相 非極性有機溶劑，如己烷 乙酸等為添加劑 常用固定相 硅膠、氧化鋁、羥基磷灰石等。,二、分配色譜的分離機理,分配色譜概述,反相色譜的主要類型，基于分子的極性分離 洗脫次序：一般為反相，即極性高的先被洗脫 常用的流動相： 有機溶劑如甲醇、乙腈，水 應(yīng)用添加劑，成為離子對、離子抑制方法 常用固定相： 碳十八、碳八、胺基等基團 反相色譜固定相多為鍵合相?,鍵合相色譜柱

14、,以硅膠為基質(zhì)，通過化學鍵合方式把碳十八、碳八、胺基等基團聯(lián)在基質(zhì)上，作為固定相。 優(yōu)點 固定相穩(wěn)定，不易流失 應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑 消除硅羥基的不良影響 缺點 pH值不能小于3 同樣填料，各種牌號色譜柱不盡相同,1. 原理： 根據(jù)各待測物在互不相溶的兩溶液中的溶解度不同，因而具有不同的分配系數(shù)。在色譜柱中，隨著流動相的移動，這種分配平衡需進行多次，造成各待測物的遷移速率不同，從而實現(xiàn)分離的過程。 2. 流動相: HPLC分析中，為防止固定相的流失，流動相與固定液應(yīng)盡量不互溶，或者說二者的極性相差越大越好。因此，根據(jù)流動相與固定相極性的差別程度，可將液液色譜分為正相分配色譜（流動相極性小于

15、固定相極性，極性小的先流出，適于極性組分分離）和反相分配色譜（流動相極性大于固定相極性，極性大的先流出，適于非極性組分分離）。,3. 固定相 原則上，用于GC的固定相也可用于HPLC作固定相。但HPLC固定液易流失，因此常用的只有幾種，按極性由高到低為：,-氧二丙腈(ODPN)、聚乙二醇(PEM)、三甲撐二醇(TMG)、十八烷(C18)、角鯊?fù)?SQ)。 根據(jù)涂漬方法的不同，可將固定相分為機械涂漬型和化學鍵合型，后者應(yīng)用更為廣泛。 1）機械涂漬固定相：將固定液通過機械混合的方法涂漬到表面多孔型(0.5-1.5%涂布量)或全多孔型載體(5-10%涂布量)上形成的液液色譜固定相。該種固定相最大的不

16、足是固定液易流失、分離穩(wěn)定性及重現(xiàn)性差，不適合梯度淋洗。 為減少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的前置柱，該柱涂有與分析柱相同但有更高含量的固定液，使流動相進入分析柱之前，預(yù)先被固定液飽和。,4. 正相和反相鍵合色譜法 正相鍵合色譜中，隨流動相極性增加，組分分配比k增加。 在HPLC分析中，有時要在流動相中加入適量的鹽(碳酸銨、四烷基銨鹽)或酸，為什么？答：都是為了防止峰形拖尾。加入鹽類是為了減少待測物與鍵合相表面的殘留硅醇基作用；加入酸是抑制酸類待測物的離解，使其以游離酸在柱內(nèi)分離。 何為正相色譜，何為反相色譜？,三、離子交換色譜 此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)相結(jié)合，測定各類陰、陽

17、離子的分離分析方法。它既適于無機離子，也適于有機物分離，如蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸等。 1. 原理：利用不同待測離子對固定相的親和能力（或離子交換能力）的差別來實現(xiàn)分離的。待測離子與離子交換樹脂固定相上帶電荷基團或游離的離子發(fā)生可逆交換反應(yīng)： 對陽離子，滯留順序為： Fe3+, Ba2+, Pb2+, Sr2+, Ca2+, Ni2+, Cd2+, Cu2+, Co2+, Zn2+, Mg2+, UO22+, Tl+, Ag+, Cs+, Rb+, K+, NH4+, Na+, H+, Li+ 對陰離子，滯留順序為：檸檬酸根, SO42-, C2O4, I-, HSO4-, NO3-, CrO42

18、-, Br-, SCN-, Cl-, HCOO-, CH3COO-, OH-, F- 思考：待測陽離子電荷越小、其水合離子的半徑越大，則越先出峰？對嗎？,離子交換樹脂的分離機理,離子交換色譜概述,適用于離子型化合物的分離 分離基于離子的帶電特性 洗脫次序受多種因素的影響 填料（離子交換樹脂）的種類陰/陽，強/弱，交換基團 樣品分子特性 鹽的種類、濃度 溫度及pH值 有機溶劑,離子交換樹脂的交換容量,2. 固定相 按離子交換劑類型分四種： 按固定相制作方法可分為： 多孔型離子交換樹脂(包括微孔型和大孔型)； 表面多孔型(包括薄膜型）離子交換樹脂； 離子交換鍵合型。,3. 流動相 離子交換色譜流動

19、相為鹽類緩沖溶液(有一定pH和離子強度) ，通過改變pH、緩沖劑類型、離子強度、加入有機試劑和配位劑等條件來控制分配比k，改變交換劑的選擇性，進而影響樣品待測物的分離。 pH值：影響酸或堿的離解平衡，控制組分離子形式所占的分數(shù)。當組分以分子形式存在時，則不被保留；離子分數(shù)越高，保留值越大。常用的有檸檬酸鹽、磷酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽和氨水等。 離子強度I：對保留值的影響比pH更大。組分保留值受流動相中鹽類總濃度控制。增加外加陰或陽離子將增加它們對R+或R-的競爭能力，使組分保留值減小。通過加入不同種類的鹽，可影響柱的選擇性，因為不同物質(zhì)對交換劑的親和能力不同。 有機溶劑：外加有機溶劑通常減小組分的

20、保留值。其極性越小，保留值越小。常用的有機溶劑有甲醇、乙醇、乙腈和二氧雜環(huán)已烷等。 配離子L：當大量L、組分X隨流動相進入柱后，發(fā)生配位劑交換： RM-L+X RM-X+L 該法用于分離各種氨基酸或堿類。 思考：離子交換色譜法中，流動相常以無機鹽的緩沖液為流動相。請問緩沖液的pH值及離子強度對分離各有何影響？,四、離子色譜 離子色譜(IC)是70年代發(fā)展的新方法。其分離原理與離子交換色譜原理一樣，只是流出的各種離子用電導(dǎo)檢測器檢測。但由于流動相都是強電解質(zhì)，其電導(dǎo)率比待測離子約高2個數(shù)量級，這種強背景電導(dǎo)會完全掩蓋待測離子信號。 為解決此問題，1975年Small 提出，在離子交換柱之后，再串

21、結(jié)一根抑制柱。該柱裝填與分離柱電荷完全相反的離子交換樹脂。通過分離柱后的樣品再經(jīng)過抑制柱，使具有高背景電導(dǎo)的流動相轉(zhuǎn)變?yōu)榈捅尘半妼?dǎo)的流動相，從而可用電導(dǎo)檢測器檢測各種離子的含量。 例如：分析陽離子時，以無機酸為流動相，抑制柱為高容量的強堿性陰離子交換樹脂，則發(fā)生下列反應(yīng)： R+OH + HCl(流動相)R+Cl- + H2O R+OH + MCl(待測物) R+Cl + M+OH- 可見，不僅大量酸轉(zhuǎn)化為低電導(dǎo)的水，而且待測離子轉(zhuǎn)化為具有更大淌度的堿。 該法的不足之處在于：抑制柱要定期再生、譜峰在經(jīng)過抑制柱后會展寬，降低分離度。因此有人提出了使用電導(dǎo)率很低的溶液(如苯甲酸鹽稀溶液)作流動相。

22、思考：IC分離中，何為抑制柱？分析陰離子時，抑制柱中應(yīng)填充何種離子交換樹脂？,五、離子對色譜法（IPC） 離子對色譜主要用來分離強極性有機酸和有機堿。 1. 原理：將與待測物離子A電荷相反的離子B（稱為對離子或反離子）加入到流動相（常為有機相）中，使待測離子A與對離子B形成離子對AB，該AB離子對的性質(zhì)與A離子或B離子的性質(zhì)不同，即間接改變了待測離子的保留特性。 例如：固定相為非極性鍵合相，流動相為水溶液，于流動相中加入與待測離子A-有相反電荷的離子B+： 由于離子對AB具有疏水性，因而被非極性固定相提取。其它待測離子A1，A2，A3.因與B離子間的成對能力不同，而形成不同疏水性的離子對，使得

23、各待測物在柱內(nèi)的保留值不同，從而達到分離的目的。 思考：有一強極性有機酸混合物，若用離子對色譜法分離，請問在流動相中應(yīng)加入陰離子還是陽離子來開成離子對？,六、體積排阻色譜法 體積排阻色譜又稱凝膠(滲透)色譜，主要用于大分子的分子分離。它是基于待測物分子的尺寸和形狀不同來實現(xiàn)分離的。 1. 分離原理：固定相為化學惰性的多孔凝膠，它類似于分子篩，但孔徑更大。凝膠內(nèi)有一定大小的空穴，分子體積大的待測物不能滲入孔穴中而被排阻，較早地被淋洗出來，中等的部分滲透，小分子則完全滲透，最后流出色譜柱。即待測物分子按分子大小(分子量大小)先后從柱中流出。 2. 固定相 3. 流動相的要求：能溶解樣品且與凝膠相似

24、(潤濕凝膠)、粘度小(增加擴散速度)。,體積排除色譜的分離機理,凝膠色譜概述,凝膠滲透（GPC）、凝膠過濾（GFC） 分離基于分子在溶液中的體積大小 洗脫次序：大分子先被洗脫 流動相不參與分離，只起溶劑作用 分離效率低 色譜行為容易預(yù)測,七、親合色譜 主要用于生物大分子與固定相之間的特異親合力進行選擇性分離及純化的方法。 分離原理：于載體表面先鍵合具有一般反應(yīng)性能的環(huán)氧或聯(lián)氨（稱為間隔臂），然后再連接上配基，如酶、抗原或激素。 當含有復(fù)雜混合試樣的流動相流經(jīng)這種經(jīng)固定化的配基時，其中具有親合力特性的生物大分子與配基相互作用而被保留，無此作用的則被洗出；隨后，改變流動相pH或組成，再將被保留的大

25、分子組分以純品的形式洗脫出來。 特點：選擇性過濾、純化效果好。,液相色譜柱及分離機理的關(guān)系,從色譜方法上分 正相 / 反相 離子交換 分子體積排除 親合 疏水回受,從柱子類型上分 分配 / 吸附 離子交換 凝膠 親合,色譜柱化學及外形結(jié)構(gòu)的關(guān)系,七 色譜分離方法的選擇,要正確地選擇色譜分離方法，首先必須盡可能多的 了解樣品的有關(guān)性質(zhì)，其次必須熟悉各種色譜方法的主要特點及其應(yīng)用范圍。 選擇色譜分離方法的主要根據(jù) 是樣品的相對分子質(zhì)量的大小，在水中和有機溶劑中的溶解度，極性和穩(wěn)定程度以及化學結(jié)構(gòu)等物理、化學性質(zhì)。 一、相對分子質(zhì)量 對于相對分子質(zhì)量較低（一般在200以下），揮發(fā)性比較好，加熱又不易

26、分解的樣品，可以選擇氣相色譜法進行分析。相對分子質(zhì)量在200 2000的化合物，可用液固吸附、液-液分配和離子交換色譜法。相對分子質(zhì)量高于2000，則可用空間排阻色譜法。,七 色譜分離方法的選擇,二、溶解度 弄清樣品在水、異辛烷、苯、四氯化碳、異丙醇中的溶解度是很有用的。水溶性樣品最好用離子交換色譜法和液液分配色譜法；微溶于水，但在酸或堿存在下能很好電離的化合物，也可用離子交換色譜法；如樣品可溶于烴類（如苯或異辛烷），（油溶性樣品或相對非極性的混合物），則可采用液一固吸附色譜；如樣品溶解于四氯化碳，則多采用常規(guī)的分配和吸附色譜分離；如樣品既溶于水又溶于異丙醇時，常用水和異丙醇的混合液作液一液分

27、配色譜的流動相，以憎水性化合物作固定相。,七 色譜分離方法的選擇,三、化學結(jié)構(gòu) 用紅外光譜法，可預(yù)先簡單地判斷樣品中存在什么官能團。然后，確定采用什么方法合適。 若樣品中包含離子型或可離子化的化合物，或者能與離子型化合物相互作用的化合物（例如配位體及有機螯合劑），可首先考慮用離子交換色譜，但空間排阻和液液分配色譜也都能順利地應(yīng)用于離子化合物；異構(gòu)體的分離可用液固色譜法；具有不同官能團的化合物、同系物可用液液分配色譜法；對于高分子聚合物，可用空間排阻色譜法?，F(xiàn)列出表作為選擇分離類型的參考。,表 液相色譜分離類型選擇參考表 溶于水排阻色譜，水為流動相 相對分子質(zhì)量 2000 不溶于水排阻色譜，非水

28、流動相 同系物分配色譜 不溶于水 異構(gòu)體吸附色譜 樣品 分子大小差異排阻色譜 反相液一液色譜 相對分子質(zhì)量 溶于水，不離解 2000 排阻色譜，水為流動相 堿陽離子交換色譜 溶于水，可離解 酸陰離子交換色譜 溶于水,離子與非離子反相離子對色譜,八、實際應(yīng)用過程注意事項,1. 選HPLC參數(shù)時的基本考慮 溶解度 - 選擇流動相的條件 分子量 - 在樣品預(yù)處理或GPC分析時有用 官能團 - 有否離子化基團? 保留特性如何? 樣品的基質(zhì) - 考慮如何前處理 在基質(zhì)中樣品的含量 - 分析、制備都考慮 檢測特性 - 有否紫外吸收? 熒光? 找出樣品中不同組份之間的差異 摸索條件的重要線索,極性問題,2.

29、 對HPLC柱的了解,平均顆粒度，顆粒度分布 顆粒度(dp) 顆粒度越?。褐г礁?傳質(zhì)好，渦流擴散小) 柱壓越高(滲透性差) 顆粒分布 顆粒分布越寬柱效低(滲透性差) 顆粒形狀 球型柱效高、重現(xiàn)性好、柱床結(jié)構(gòu)均勻 無定型：柱床結(jié)構(gòu)不均勻 流動相線性速度不均勻 譜帶擴展,對HPLC柱的了解（二）,平均孔徑/孔體積 孔徑/孔體積分布 大的孔徑可分析高分子量的分子,對HPLC柱的了解（三）,鍵合相化學 影響化合物的分離度：a 不同鍵合相對不同種類的化合物分離不同 可能導(dǎo)致色譜的分離機理不同 如：C18、C8、CN,對HPLC柱的了解（四）,含碳量 含碳量越高，k值越大（固定相傳質(zhì)效應(yīng)增加） 高含碳

30、量 有利于不易保留的化合物的分離 水解穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性好 有利于極性化合物的拖尾改善 低含碳量 有利于分析中性及堿性化合物 降低溶劑損耗,不同色譜柱的含碳量,色譜柱C% k苊 (50/50的乙腈/水) Symmetry C181917 Zorbax ODS1715.7 LiChrosorb RP-181510.3 Symmetry C81212.5 Resolve C-181212.4 Ultrasphere ODS1111.3 Partisil ODS-31112.0 mBondpak C-1810 7.9 Nova-Pak C-18 7 5.5,對HPLC柱的了解(五),填料的端基封口 封

31、口殘余硅羥基 減少不可逆吸附或拖尾 增加碳含量（0.1% - 1%）,殘基處理的效果,NovaPak C18,未封口 C18, 抗壞血酸 煙酰胺 對氨基苯甲酸 哌咯西叮 核黃素 苯酚 鹽酸硫胺,對HPLC柱的了解（六）,硅膠的活性 主要影響堿性化合物的保留行為：k 生產(chǎn)硅膠時處理溫度不同，硅膠活性也不同 是選擇性差異的主要來源 硅膠的雜質(zhì)含量 重金屬含量低，硅羥基活性小，拖尾減小 是色譜柱質(zhì)量好壞的重要標志,對HPLC柱的了解（七）,填料的穩(wěn)定性 硅膠填料 pH：2-8 聚合物填料 pH：2-12 pH值小于2時鍵合相水解,新一代硅膠基質(zhì)的色譜柱,Symmetry 高純度硅膠：Fe，Al，Mg

32、等均10ppm 孔徑100A，5m球形顆粒，端基封口 超高含碳量：C18/19%，C8/12% 表面積：300 m2/g 孔體積：1mL/g 特點 好峰形，好重現(xiàn)性，不同的選擇性，使用壽命長,Waters聚合物基質(zhì)的反相柱,特殊設(shè)計的多孔聚合物膠 有很寬的 pH 適應(yīng)范圍（2-12） 可用離子抑制方法分析堿性化合物 有非常不同的選擇性 柱效及韌性比相應(yīng)的硅膠柱低 色譜機理不太清楚 文獻背景低，用戶少,色譜柱的規(guī)格,內(nèi)徑 檢測的靈敏度 樣品的容量 長度 分離度，理論塔板數(shù) 速度 樣品的容量 檢測的靈敏度,色譜柱的清洗,對所做的樣品要有充分的了解 用對該樣品洗脫能力最強的流動相清洗 硅膠柱的一般方

33、法 先用甲醇洗去極性雜質(zhì) 用干燥的二氯甲烷、正庚烷100200ml依次活化 鍵合相柱(烷基)的一般方法 20倍柱體積的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次沖洗,3. 流動相及樣品的預(yù)處理,液相色譜對流動相的要求 除色譜柱對流動相對的要求外，還有 與檢測器匹配 脫氣 避免鹵素離子（不銹鋼系統(tǒng)） 溶劑的粘度 細菌的生長,流動相的脫氣,流動相脫氣的目的 使色譜泵的輸液準確 輸液均勻準確，并且脈動減小 保留時間及色譜峰面積的重現(xiàn)性提高 提高檢測的性能 防止氣泡引起的尖峰 基線穩(wěn)定，信噪比增加 溶劑的紫外吸收本底降低 保護色譜柱 減少死體積 防止填料的氧化,流動相脫氣的方法,加熱 簡單，如同抽真空一起使用，其效果

34、很好。但容易造成流動相組成的變化 抽真空 同上，一般在溶劑抽濾的同時，也有脫氣的效果 超聲波 簡單，但效果不理想。 通惰性氣體（一般用氦氣） 可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度 脫氣機 可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度,樣品的預(yù)處理,樣品預(yù)處理的目的 除去微粒 減少干擾雜質(zhì) 濃縮微量的組份 提高檢測的靈敏度及選擇性 改善分離的效果 有利于色譜柱及儀器的保護,樣品的預(yù)處理重要性,占樣品分析時間的比例 樣品預(yù)處理所用時間遠大于色譜分離的時間 占分析的消耗總成本最大 消耗大量的溶劑及其他化學品 實驗的重復(fù)性及準確性最差的環(huán)節(jié) 影響實驗結(jié)果好壞的最重要因素 是決定性的步驟,樣品預(yù)處理常用的方法,高速離心 過

35、濾、超濾 選擇性沉淀 衍生反應(yīng) 液-固萃取 / 液-液萃取 Sep-Pak樣品處理小柱 其他,樣品預(yù)處理的過程,去除微粒,過濾 過濾膜/過濾裝置 有機(0.5m)/無機(0.45m) 膜片可更換 一次性使用的膜“Cartridge” 使用方便簡單，交叉污染小 有更小內(nèi)徑，可用于微量樣品的處理 高速離心 大于：10,000g,超濾,機理 超濾是一種基于分子量分離的技術(shù) 目的 根據(jù)分子量的不同把分子、細胞及病毒等分為不同的餾份 除去小分子樣品中的大分子蛋白 脫鹽,選擇性沉淀,常用于生化樣品中除蛋白 有機溶劑 乙腈，甲醇 強酸 三氯乙酸，過氯酸 鹽 50% 硫酸銨 10% TCA,樣品衍生,提高檢測

36、的靈敏度 增加紫外基團以增強紫外檢測的靈敏度 增加熒光基團使樣品用高靈敏度熒光檢測器 改變分離的選擇性 改變組份的基團，如： 變離子型化合物為非離子型，用反相方法分離 典型的例子 氨基酸分析,樣品衍生氨基酸分析,AccQ-Tag 衍生法,濃縮樣品,濃縮樣品的方法 萃取/吹干 沉淀/再溶解 色譜法 液固抽提/Sep-Pak小柱,固相萃?。⊿PE）技術(shù),固相萃取技術(shù)是基于同液相色譜同樣技術(shù)開發(fā)的產(chǎn)品，分離復(fù)雜樣品中的不同組份 固相萃取技術(shù)（SPE）的重要性 實驗室中6080%的成本及工作量在樣品制備上 加速樣品的制備時間 降低樣品前處理的成本 提高分析的準確性及回收率 更容易自動化 減少樣品處理步驟 降低對不穩(wěn)定樣品的影響 提高安全性,Waters的Sep-Pak小柱,Waters專門開發(fā)了固相萃取技術(shù)（SPE） Sep-Pak小柱的應(yīng)用領(lǐng)域 除去雜質(zhì)及干擾組份 把樣品分成不同極性的組分析 富集微量的組份 Sep-Pak小柱的主要種類 反相 正相 離子交換,Sep-Pak的種類,根據(jù)Sep-Pak及樣品的