1、HBV DNA定量和變異檢測(cè)的臨床應(yīng)用,李繼剛 2012.02,徐州市第六人民醫(yī)院,目錄,HBV病毒介紹 HBV DNA定量檢測(cè)的臨床意義 HBV DNA定量檢測(cè)的方法 HBV DNA分型的臨床意義 YMDD檢測(cè)的應(yīng)用,一、HBV病毒介紹,1.流行狀況 乙型肝炎病毒嚴(yán)重威脅著世界人民的身體健康，我國(guó)屬于高發(fā)地區(qū)，據(jù)衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)，乙肝病毒攜帶者占10%，20006000萬(wàn)人患有乙型肝炎，每年有28萬(wàn)人死于乙型肝炎病毒感染。,圖1.HBV世界流行分布圖,圖2.2006年統(tǒng)計(jì)乙肝病毒攜帶者分布范圍,注： 1.低流行地區(qū)：北美、北歐和英國(guó)等； 2.中流行區(qū)：南歐、西南亞、俄羅斯等； 3.高流行區(qū)：,2.

2、乙肝病毒生物學(xué)特性,圖3.乙肝病毒電鏡圖：A和C球形，B桿狀,外殼：前S1抗原，S1抗原，S2抗原等； 核心：基因組，核心蛋白，DNA聚合酶等；,圖4.乙肝病毒模式圖,HBV DNA負(fù)鏈有四個(gè)開(kāi)放區(qū)，分別稱(chēng)為S、C、P及X(圖26-2)，能編碼全部已知的HBV蛋白質(zhì)。S區(qū)可分為二部分，S基因和前S基因。S基因(核苷酸155833)能編碼主要表面蛋白。S基因之前是一個(gè)能編碼163個(gè)氨基酸(2，848-154)的前S基因，編碼Pre S1和Pre S2蛋白。C區(qū)基因包括前C基因和C基因，分別編碼HBeAg和HBcAg。P區(qū)最長(zhǎng)，約占基因組75%以上，編碼病毒體DNA多聚酶。X區(qū)(核苷酸1，3741

3、，835)可能編碼有154個(gè)氨基酸的堿性多肽，長(zhǎng)鏈的裂口位于此區(qū)。,圖5.HBV DNA模式圖,3.傳染源:各種類(lèi)型的乙肝患者和HBsAg攜帶者.潛伏期為6周至6個(gè)月，平均為3個(gè)月. 4.傳播途徑:由于HBV存在于血液，唾液、淚液、腹水、羊水、尿、精液、陰道分泌物、月經(jīng)血和乳汁等中，所以傳播途徑多樣且復(fù)雜.但主要經(jīng)血液、母嬰和接觸傳播.,1.高度敏感，可以將HBV的窗口期由60天縮短到49天。從理論上來(lái)說(shuō)，每毫升血清只要有一個(gè)病毒就可以檢出。 2.基因突變可以導(dǎo)致傳統(tǒng)免疫學(xué)檢測(cè)陰性，而基因檢測(cè)可以避開(kāi)突變區(qū)域，根據(jù)其高度保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，使其檢測(cè)結(jié)果不受突變影響。例如前核心區(qū)域的突變可以引入終止

4、密碼子，使,二、HBVDNA 定量檢測(cè)的臨床意義,HBeAg的合成提前終止，但新的病毒仍能合成，肝損傷仍在繼續(xù)。 3.對(duì)肝移植的意義 肝臟移植是目前治療肝硬化晚期的唯一方法，但是85%以上的既往HBV攜帶者在因肝移植免疫損傷后重新出現(xiàn)，。HBV DNA檢測(cè)對(duì)肝移植的跟蹤監(jiān)測(cè)具有重要意義。 4.監(jiān)測(cè)母嬰傳播 聯(lián)合應(yīng)用高效價(jià)免疫球蛋白和乙肝疫苗可以有效阻斷母嬰傳播，但仍有些嬰兒不敏感，監(jiān)測(cè)嬰兒血中的HBV DNA可以對(duì)此進(jìn)行監(jiān)測(cè)，分析阻斷失敗的原因。 5.檢測(cè)藥物療效,1.Real time PCR （1）原理 通過(guò)對(duì) PCR 擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性

5、的分析。在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著 PCR 反應(yīng)的進(jìn)行，PCR 反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)。,三、HBV DNA定量檢測(cè)的方法,圖6.實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)曲線(xiàn),由于熒光值突破背景到達(dá)閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)與模板初始拷貝數(shù)成正比，可以根據(jù)此原理繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。 根據(jù)待測(cè)樣本管熒光值到達(dá)閾值經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，可以確定樣品中該基因的初始模板量。,圖7.實(shí)時(shí)定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),（2）常用的熒光物質(zhì) a.Sybgreen 該染料嵌合到DNA雙鏈中后，經(jīng)過(guò)激

6、發(fā)光激發(fā)后發(fā)出熒光，熒光強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物量成正比。,圖8. Sybgreen發(fā)光原理,優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn) a.價(jià)格便宜; b.可以做融解曲線(xiàn)分析。 缺點(diǎn) a.特異性不夠好； b.染料對(duì)PCR擴(kuò)增有一定的抑制作用； c.對(duì)技術(shù)人員的理論水平有較高的要求。,b.Taqman 探針 TaqMan 探針是一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列的擴(kuò)增相關(guān)。它設(shè)計(jì)為與目標(biāo)序列上游引物和下游引物之間的序列配對(duì)。熒光基團(tuán)連接在探針的 5末端，而淬滅劑則在 3末端。當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對(duì)時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與 3端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)，聚合酶的 5外切酶活性將探針進(jìn)行酶切，使得熒光基團(tuán)與淬滅

7、劑分離。 TaqMan 探針適合于各種耐熱的聚合酶，如 DyNAzymeTM II DNA 聚合酶（ MJ Research 公司有售）。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來(lái)的熒光基團(tuán)不斷積累。因此熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系。,探針序列與目標(biāo)序列上游引物和下游引物之間的序列配對(duì)。熒光基團(tuán)連接在探針的 5 末端，而淬滅劑則在 3 末端。,當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對(duì)時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與 3 端的淬滅劑接近而被淬滅。,但在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)，聚合酶的 5 外切酶活性將探針進(jìn)行酶切，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離。,發(fā)光,圖9. Taqman 探針發(fā)光原理,圖10. Taqman 探針發(fā)光原理,優(yōu)點(diǎn) a

8、.特異性高于DNA染料法，因?yàn)樘结樞蛄幸c目的序列互 補(bǔ)； b.擴(kuò)增后的分析對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的理論要求低于DNA染料法。 缺點(diǎn) a.無(wú)法進(jìn)行融解曲線(xiàn)的分析； b.設(shè)計(jì)成本較高，價(jià)格昂貴。,分子信標(biāo)（molecular beacon） light upon extention primers(LUX primers) 2.連接酶鏈反應(yīng)（LCR）,四、HBV 基因分型,1.分型原理 全基因組序列差異=8%或S區(qū)DNA序列差異=4%定義為一個(gè)基因型，目前發(fā)現(xiàn)HBV存在A、B、C、D、E、F、G、H8個(gè)基因型。,2.分型方法 （1）全基因組測(cè)序 優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確 缺點(diǎn):耗時(shí)耗力，昂貴,需要測(cè)序儀 （2）限制性片段

9、多態(tài)性分析（RFLP） 優(yōu)點(diǎn):特異性高 缺點(diǎn):耗時(shí)，多用于科研 （3）PCR-ELISA 生物素包被微孔，將親和素標(biāo)記的探針固定在膜上，使用生物素或地高辛標(biāo)記的引物擴(kuò)增目標(biāo)片段，擴(kuò)增產(chǎn)物帶有標(biāo)記物，產(chǎn)物與探針結(jié)合。相繼加入抗生物素或地高辛抗體，以后同ELISA。,優(yōu)點(diǎn)：比PCR敏感幾十倍，且 可以使用不同的探針進(jìn)行分型，已經(jīng)有商品化試劑盒 缺點(diǎn):微量的污染即可導(dǎo)致假陽(yáng)性且需進(jìn)行PCR和ELISA兩步操作。 (4)反向斑點(diǎn)雜交 原理基本同PCR-ELISA，不同的是將探針固定在同一張膜上，操作方便，所需PCR產(chǎn)物的體積小，已經(jīng)開(kāi)始在臨床上廣泛應(yīng)用。 （5）Real-time PCR 是目前最流行

10、最簡(jiǎn)便的方法。原理是根據(jù)不同的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)多對(duì)引物和探針，平行擴(kuò)增，實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。 優(yōu)點(diǎn):定量，方便 缺點(diǎn)：需要多個(gè)反應(yīng)體系,2.臨床意義 （1）不同的基因型對(duì)藥物的敏感性不同， A型對(duì)普通干擾素更敏感，長(zhǎng)效干擾素對(duì)各型的作用基本相同。 （2）臨床表現(xiàn)及預(yù)后不同。C型多為急性或重型肝炎，預(yù)后差 （3）地區(qū)差異，我國(guó)各型均有，北方以C型為多，南方多為B型，藏族地區(qū)以D型為主 （4) 基因的變異可以導(dǎo)致HBsAg和HBeAg陰性,五.YMDD檢測(cè)的臨床應(yīng)用,1.定義 HBV P區(qū)編碼的DNA聚合酶基因在739或741位點(diǎn)發(fā)生突變，其編碼的HBV逆轉(zhuǎn)錄酶活性部位“酪氨酸（Y）蛋氨酸（M）天門(mén)冬氨酸（

11、D）天門(mén)冬氨酸（D）”(YMDD主型區(qū))，變?yōu)椤袄野彼幔╕）纈氨酸（V）天門(mén)冬氨酸（D）天門(mén)冬氨酸（D）”（YVDD）或“酪氨酸（Y）異亮氨酸（I）天門(mén)冬氨酸（D）天門(mén)冬氨酸（D）”（YVDD）導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄酶亞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，妨礙了與拉米夫定的結(jié)合，從而造成HBV對(duì)拉米夫定敏感性下降。,Val-GTGYVDD Ile-ATT ATC YIDD ATA,Met-ATGYMDD,圖12. YMDD變異原理,圖13. Lamivudine 作用位點(diǎn),Nucleotides,ss (-) DNA,(variant),Y,V/I,D,D,reduced affinity,圖14. Lamivudine 耐藥

12、機(jī)制,拉米夫定治療HBV感染治療過(guò)程與YMDD變異關(guān)系,引自J Virol. Metods 1999；83：181-187,2.YMDD變異檢測(cè)對(duì)用藥的指導(dǎo)意義 Lamifudine對(duì)HBV YMDD野生型的抗病毒作用優(yōu)于Adefovir，而且對(duì)機(jī)體潛在副作用也小于Adefovir，所以針對(duì)攜帶HBV YMDD野生型患者，首選擇Lamifudine。 在Lamifudine治療過(guò)程中動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)YMDD變異情況，一旦出現(xiàn)YMDD變異，改用Adefovir，這樣可以持續(xù)抑制病毒變異株，第一時(shí)間就使病毒變異株就處在抑制狀態(tài)。 在使用Adefovir藥物治療過(guò)程，也動(dòng)態(tài)檢測(cè)YMDD變異情況，防止YMDD

13、野生株回復(fù)成優(yōu)勢(shì)株，一旦出現(xiàn)YMDD野生株成為優(yōu)勢(shì)株，改用Lamifudine或者聯(lián)合Lamifudine和Adefovir抗HBV治療是可取的。通過(guò)對(duì)YMDD變異的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，有助于合理選擇藥物，長(zhǎng)期使HBV處于低水平復(fù)制狀態(tài)，甚至耗竭HBV cccDNA庫(kù)，達(dá)到徹底消除HBV的目的。,3.常見(jiàn)檢測(cè)方法 基因測(cè)序法 ELISA法 反向斑點(diǎn)雜交 先對(duì)YMDD區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，以固相探針釣取生物素或其他活性物質(zhì)標(biāo)記的PCR產(chǎn)物，檢測(cè)標(biāo)記物。,Real-time PCR (1)探針?lè)?圖15. YMDD變異檢測(cè)引物和探針設(shè)計(jì),（2）融解曲線(xiàn)法,圖16. 融解曲線(xiàn)法檢測(cè)YMDD，單一產(chǎn)物,圖17. 融解曲線(xiàn)法檢測(cè)YMDD，混合產(chǎn)物,1.X區(qū)突變 （1）基本核心啟動(dòng)子：控制核心RNA和前核心RNA的轉(zhuǎn)錄。核心RNA編碼核心蛋白。前核心RNA編碼e抗原前體。,五.HBVDNA其他突變,2.C區(qū)及前C區(qū)突變,3