1、16 DNA復制,12.1 DNA復制是半保留式的 12.2 DNA復制是雙向進行的 12.3 DNA聚合酶III催化復制叉處的聚合反應 12.4 DNA聚合酶III同時催化兩條鏈的合成 12.5 復制叉移動需要多蛋白復合物 12.6 DNA復制起始于細菌染色體上的唯一的一個部位 12.7 DNA復制終止于ter區(qū) 12.8 DNA復制的其它方式 12.9 損傷的DNA可以修復,遺傳中心法則,DNA復制,RNA復制,轉(zhuǎn)錄,逆轉(zhuǎn)錄,翻譯,蛋白質(zhì),Meselson- Stahl實驗： 1、使E.coli在含有唯一氮源15N （15NH4Cl）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，合成的所有核苷酸都含有15N ，具有較高

2、的密度，都整合到親代DNA中。 2、將生長在15NH4Cl培養(yǎng)基的E.coli轉(zhuǎn)移到含有唯一氮源，但密度較低的14N （14NH4Cl）培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)兩代，并分別取每一代的DNA進行密度梯度離心。,12.1 DNA復制方式是半保留式,首先在15NH4Cl培養(yǎng)基中培養(yǎng),然后轉(zhuǎn)到14NH4Cl培養(yǎng)基中培養(yǎng),只在15NH4Cl 中培養(yǎng),只在14NH4Cl 中培養(yǎng),14N對照系統(tǒng),15N對照系統(tǒng),第一代,第二代,提取DNA，進行密度梯度超離心,E.coli 細胞,用15N標記的親本DNA,14N中第一次復制,14N中第二次復制,實驗結(jié)果表明DNA復制是半保留復制,（a）密度梯度離心的DNA帶 （b

3、）對應于左側(cè)DNA帶的解釋,Meselson-stahl 實驗,從前面圖可以看出，在含有14N氮源介質(zhì)中培養(yǎng)一代的DNA經(jīng)密度梯度離心后，DNA帶位于在15N培養(yǎng)基中的DNA帶的上面。 在含有14N氮源介質(zhì)中培養(yǎng)兩代后的DNA經(jīng)密度梯度離心后，出現(xiàn)兩條帶，第一條帶位置與培養(yǎng)一帶的DNA帶相同，另一條DNA帶位于第一條帶上面，說明第二條帶密度更輕。 實驗結(jié)果充分說明DNA復制是半保留復制。,兩種復制模式 （a）單向復制模式 （b）雙向復制模式,12.2 DNA復制是雙向進行的,大腸桿菌染色體DNA雙向復制模式,復制起點,復制叉,復制叉,真核生物DNA復制有多個復制起點，同時雙向復制,DNA合成時

4、，核苷酸是通過酶催化加到一個正在延伸的DNA鏈上，這種酶要求一條完整的DNA鏈作為模板，去合成一條互補鏈，所以這樣的酶叫做DNA指導的DNA聚合酶。 Arthur Kornberg（斯坦福大學醫(yī)學院教授）等人從1955年開始尋找合成DNA的酶。于1956年在大腸桿菌的提取液中發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶。 Kornberg發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶就是現(xiàn)在的DNA聚合酶I，是分子量為109,000的一條多肽鏈，具有聚合活性及3-5外切酶活性，還有5-3核酸酶活性。以后又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了功能不同的另外幾種DNA聚合酶，下表歸納了到目前為止從大腸桿菌和哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶的基本特征。,12.3 DNA聚合酶III

5、催化復制叉處的聚合反應,見P414；其中；Klenow片段：,PolIII的結(jié)構(gòu)和功能，見P416,聚合反應的基本過程都是通過新合成的鏈的3-OH對進入的新的核苷三磷酸（用d NTP）的磷進行親核攻擊，導致磷酯鍵斷裂，結(jié)果在鏈的3末端加上了一個新的核苷酸，即延長了一個核苷酸。 釋放出的焦磷酸經(jīng)焦磷酸酶水解有利于聚合反應的進行,雙重核對功能：DNA聚合酶的選擇作用； 3-5外切酶的校對作用。 右圖為“酶對底物的專一性的校正反應”。 詳見P414415,由于DNA的兩條模板鏈是反平行的，又因為DNA總是沿5 3方向合成，即兩條新鏈是沿著相反方向合成。換句話說，就是一條子鏈的合成方向與復制叉移動的方

6、向一致，該子鏈稱為前導鏈；而另一條子鏈與復制叉移動的方向相反，這條鏈稱之為滯后鏈，但也是通過通過5 3方向聚合形成的。 12.4.1 在滯后鏈中DNA的合成是不連續(xù)的 根據(jù)崗崎實驗，可以確定復制叉的一個“杈”（前導鏈）是沿5-3方向連續(xù)合成的，而另一條鏈（滯后鏈）是通過崗崎片段方式不連續(xù)合成的。連續(xù)和不連續(xù)合成的結(jié)合使得復制叉整體向一個方向延伸。,12.4 DNA聚合酶III同時催化兩條鏈的合成,崗崎片段,復制叉移動方向,先導鏈,滯后鏈,DNA聚合酶III同時催化兩條鏈的合成,前導鏈和滯后鏈的合成,12.4.2 每個崗崎片段的合成開始于一個RNA引物 不連續(xù)合成解釋了滯后鏈是怎樣合成的，但不能

7、解釋每個崗崎片段是怎樣開始合成的。DNA聚合酶III不能從頭開始進行聚合反應，它只能將核苷酸加到已有的多核苷酸鏈上。所以為了合成滯后鏈，需要在復制叉處合成一系列的短的RNA引物。每個RNA引物都是與滯后鏈模板部分互補的，而且在DNA聚合酶III催化下從引物 3端延伸形成崗崎片段。 RNA引物是通過引發(fā)酶合成的，引發(fā)酶是一個稱為引發(fā)體的大的復合物中的成分，引發(fā)體還包括使DNA解旋的解旋酶和其它的一些輔助蛋白。引發(fā)酶每秒鐘催化一個大約長10個核苷酸的RNA引物的合成。由于復制叉移動的速度大約為每秒1000個核苷酸，所以大約每1000個核苷酸就要合成一個RNA引物。,12.4.3 DNA pol I

8、切去RNA引物，并使崗崎片段延伸,DNA pol I 識別并結(jié)合于新DNA鏈的3端和下一個RNA引物之間的切口。然后5 3外切酶活性催化第1個RNA核苷酸水解，而5 3聚合酶活性將一個脫氧核苷酸加到新DNA鏈的3端，這種同時降解和合成的過程稱為切口平移。 通過這種方式，使得切口沿滯后鏈移動。在完成切去RNA引物和填充RNA引物切去后的空缺后，DNA pol I 脫離DNA，留下了被一個切口（一個磷酸二酯鍵的空）分開的雙鏈DNA。 最后在DNA連接酶催化下，一個崗崎片段的3末端和另一個崗崎片段的5磷酸基團之間形成一個磷酸二酯鍵，完成了兩個崗崎片段的合成。,引發(fā)體,引物酶,DNA聚合酶III,DN

9、A聚合酶I,DNA連接酶,滯后鏈,前導鏈,單鏈結(jié)合蛋白,解旋酶,12.5 復制叉移動需要多蛋白復合體,復制叉的移動除了需要用于聚合反應的DNA pol III以外，至少還需要四種其它蛋白質(zhì)。其中主要的蛋白是解旋酶、拓撲異構(gòu)酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA引發(fā)酶（也稱為引物合成酶）。,解旋酶：是個需要ATP的酶，該酶剛好在移動的復制叉的前面沿著單鏈DNA滑動。E.coli中最重要的解旋酶是DnaB，它是一個與引發(fā)體中的引發(fā)酶緊密聚合的蛋白質(zhì)。DnaB使復制叉前面的雙螺旋DNA解旋，解旋過程是與核苷三磷酸水解過程相偶聯(lián)的。 拓撲異構(gòu)酶I和II：是用來將解旋酶作用后產(chǎn)生的扭轉(zhuǎn)張力釋放掉。DNA快速解旋在復制

10、叉處形成超螺旋頭部。拓撲異構(gòu)酶I是切斷DNA中的一條鏈，使DNA旋轉(zhuǎn)，而拓撲異構(gòu)酶II可以切斷DNA的兩條鏈。,單鏈結(jié)合蛋白（SSB）：其作用是當解旋酶作用后，它可以防止解開的螺旋恢復原來狀態(tài)。它對單鏈DNA有非常高的親和性，在滯后鏈合成的開始需要單鏈結(jié)合蛋白，螺旋解旋后，前導鏈可以連續(xù)合成時就不需要這種蛋白了。 DNA引發(fā)酶：這個酶沿著滯后鏈在有規(guī)則的間隔內(nèi)合成短的RNA引物。然后通過DNA pol III在引物的3-OH端沿著5-3方向合成崗崎片段。RNA引物可以被DNA pol I除去，然后用互補的脫氧核苷酸填上。在復制起點處前導鏈合成開始時也需要引發(fā)酶。,DNA連接酶（1967年發(fā)現(xiàn)）

11、：若雙鏈DNA中一條鏈有切口，一端是3-OH，另一端是5-磷酸基，連接酶可催化這兩端形成磷酸二酯鍵，而使切口連接。 但是它不能將兩條游離的DNA單鏈連接起來。 大腸桿菌和其它細菌的DNA連接酶要求NAD+提供能量，在高等生物和噬菌體中，則要求ATP提供能量。T4噬菌體的DNA連接酶不僅能在模板鏈上連接DNA和DNA鏈之間的切口，而且能連接無單鏈粘性末端的平頭雙鏈DNA。,連接酶的反應機制： 酶 + NAD+(ATP) 酶-AMP + 煙酰胺單核苷酸（PPi） 酶-AMP + P-5-DNA 酶 + AMP-P-5-DNA DNA-3-OH + AMP-P-5-DNA DNA-3-O-P-5-D

12、NA+AMP DNA連接酶在DNA復制、損傷修復、重組等過程中起重要作用作用,DNA復制示意圖,復制體(replicon),在DNA復制過程中，由眾多的酶和蛋白質(zhì)參與DNA的復制作用。 復制體的基本活動包括： 1）雙鏈的解開； 2）RNA引物的合成； 3）DNA鏈的延長； 4）切除RNA引物，填補缺口，連接DNA片段； 5）切除和修復錯配堿基。,E.coli中，是位于稱為oriC遺傳位點的單一一個起點。oriC區(qū)含有兩種重復類型的多個拷貝，DnaA結(jié)合部位含有一個特殊的9堿基對重復序列（4個拷貝），另一部位是富含A-T13堿基對的重復區(qū)（3個拷貝）（圖a）。 圖b給出了在oriC處復制起始模式

13、。大約有20個 DnaA蛋白與9堿基對重復區(qū)結(jié)合，并引起DNA結(jié)構(gòu)的變化，導致富含13個A-T堿基對重復區(qū)內(nèi)雙螺旋變性。(見P422表34-4) 富含A-T重復區(qū)的部位起著使復制泡中心定位的作用。一旦這個區(qū)接近其它DNA復制蛋白，在解旋酶和SSB作用下復制泡沿雙向延伸形成兩個復制叉。然后引發(fā)酶合成RNA引物，而DNA pol III開始前導鏈和滯后鏈的合成。,12.6 細菌中的DNA復制起始于染色體上唯一的一個部位,E.coli 的oriC結(jié)構(gòu)模式：a. OriC內(nèi)富含A-T序列和4個9堿基對重復序列的分布；b.在oriC處復制起始模式,在ter區(qū)內(nèi)存在5個DNA序列（terA到terE）。t

14、er序列排列在染色體上制造了一個復制叉“陷井”區(qū)，復制叉可以進入但不能出來。順時針陷井由terB和terC構(gòu)成，反時針陷井由terA、terD和terE構(gòu)成。 陷井區(qū)是終止子利用物質(zhì)（Tus）的結(jié)合部位。Tus可以和每一個ter結(jié)合。一旦形成Tus-ter復合物，就可以通過阻止解旋酶解旋DNA來封閉復制叉的通路。Tus-ter復合物只捕獲來自一個方向（順時針或反時針）的復制叉，而對來自另一個方向（反時針或順時針）的復制叉不起作用。 終止區(qū)這樣安排可確保兩個從相反方向進入ter區(qū)的復制叉總能相遇，當一個復制叉遇到另一個復制叉時，DNA復制就完成了。,12.7 DNA復制終止于ter區(qū),E.Col

15、i中的ter區(qū)組織 600kb ter區(qū)含有5個非對稱的ter部位，每個都可與Tus結(jié)合。 箭頭表示為每個復制體設置的可能的終止部位,真核生物染色體一般都比細菌染色體大得多，如E,coli基因組是由4.6103kb組成的單一染色體，而真核生物通常含有一個以上的染色體，一般在20至30對染色體之間。雖然染色體數(shù)目的增加使得基因組更復雜，但所有生物中的DNA復制的生物化學機制基本上是類似的。 真核生物DNA復制還有以下一些特點: 真核生物所含的DNA聚合酶種類更多些。 真核生物復制叉處需要的輔助蛋白不同。 真核生物也象E.coli那樣，復制是雙向的。但E.coli染色體含有唯一的復制起點，而真核生

16、物染色體存在許多復制起點。,12.8 真核生物DNA復制類似于原核生物DNA復制,真核生物中DNA的復制特點,1、真核生物染色體有多個復制起點，多復制眼，呈雙向復制，多復制子。 2、岡崎片段長約200bp. 3、真核生物DNA復制速度比原核慢。 4、真核生物染色體在全部復制完之前起點不再重新開始復制；而在快速生長的原核中，起點可以連續(xù)發(fā)動復制。真核生物快速生長時，往往采用更多的復制起點。 5、真核生物有多種DNA聚合酶。 6、真核生物線性染色體兩端有端粒結(jié)構(gòu)，防止染色體間的末端連接。由端粒酶負責新合成鏈5RNA引物切除后的填補，亦保持端粒的一定長度。,滾環(huán)復制 首先一個引發(fā)體組裝在模板鏈（鏈）

17、上 ，開始合成RNA引物，然后在DNA pol III作用下，引物延伸生成一個互補鏈（鏈）。 生成的雙鏈DNA分子通過一個噬菌體編碼的內(nèi)切酶在鏈上的特定部位制造一個缺口。 最后在DNA pol III作用下，鏈從暴露出的3羥基延伸，取代原來的鏈。,12.9 DNA復制的其它方式,線粒體DNA的復制采取的是一種特殊的D-環(huán)復制方式： 環(huán)狀雙螺旋DNA在某一點解旋，開始復制。但前導鏈和滯后鏈的起點不在同一位點。 首先合成前導鏈，結(jié)果一條鏈（滯后鏈模板）仍維持單鏈。形成一個D字型的環(huán)。當前導鏈合成到某一點時，露出滯后鏈的起點，滯后鏈開始復制。,D-環(huán)復制,逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組是RNA分子，在感染期間，

18、RNA分子可以逆轉(zhuǎn)錄為DNA分子。DNA再轉(zhuǎn)錄生產(chǎn)病毒RNA，或者與宿主DNA分子整合，使病毒潛伏于宿主后代中。 將逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA轉(zhuǎn)換成DNA的最關鍵酶是逆轉(zhuǎn)錄酶。該酶具有RNase H活性（降解RNA活性）和DNA聚合酶活性。,12.10 利用RNA作為模板，逆轉(zhuǎn)錄酶可以催化DNA合成,mRNA,RNA-DNA雜化體,單鏈DNA,雙鏈DNA,mRNA的cDNA拷貝,逆轉(zhuǎn)錄病毒生活循環(huán)中的7個主要過程, 逆轉(zhuǎn)錄病毒進入宿主細胞； 在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，以病毒的RNA為模板合成互 補DNA（cDNA），形成RNA-DNA雜化體，逆轉(zhuǎn)錄酶 將雜化體中的RNA降解，同時以剩下的DNA鏈為模 板合成另

19、一條互補的DNA鏈，結(jié)果形成雙鏈DNA； 雙鏈DNA整合到宿主DNA中； 利用宿主復制和轉(zhuǎn)錄機器生產(chǎn)大量的病毒RNA； 轉(zhuǎn)錄出的mRNA翻譯成病毒的包膜蛋白，逆轉(zhuǎn)錄酶 和殼體蛋白；, 將病毒RNA、逆轉(zhuǎn)錄酶和殼體蛋白組裝成病毒 的核殼體； 核殼體結(jié)合包膜蛋白形成完整的逆轉(zhuǎn)錄病毒。 逆轉(zhuǎn)錄酶沒有3 5外切酶活性或校正活性，所以它的錯誤率比任何DNA聚合酶都高，例如人免疫缺陷病毒I（HIV I）逆轉(zhuǎn)錄酶每合成2000到4000核苷酸就會摻入一個不正確的堿基，這也部分說明了HIV I的高突變率。,12.11 損傷的DNA可以修復,1、脫嘌呤、脫氨和形成胸腺嘧啶二聚體都可能造成DNA損傷 DNA損傷常

20、見形式是通過N-糖苷鍵的水解，鳥嘌呤或腺嘌呤的自發(fā)脫嘌呤作用形成脫氧核糖。據(jù)估計人體內(nèi)細胞中每天每109堿基對就有多達103堿基對發(fā)生脫嘌呤。另一種類型損傷是胞嘧啶脫氨形成尿嘧啶，如果不能校正，在DNA復制后，一個C-G堿基對就將變成一個A-T堿基對了。,化學因素：如亞硝酸與亞硝酸鹽，可加速C脫氨基生成U，A脫氨基生成I。,胞嘧啶脫氨如不校正將導致： G-C突變?yōu)锳-T,C,U,U A,紫外線和離子輻射誘導有可能形成胸腺嘧啶二聚體。一個胸腺嘧啶的C-5、C-6與相鄰胸腺嘧啶上同樣位置的碳之間形成一個環(huán)丁基環(huán)，結(jié)果使得DNA骨架的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，有可能引起與互補鏈上的相應的腺嘌呤殘基之間的氫鍵斷

21、裂。,胸腺嘧啶形成的示意圖,2 在E.coli中存在5種基本的修復系統(tǒng) E.coli中存在的5種基本類型的DNA修復系統(tǒng)：直接修復， (核苷酸與堿基)切除修復、錯配修復、重組修復和SOS修復。 A.直接修復 某些損傷的核苷酸和錯配的堿基可以被某些蛋白質(zhì)識別和修復。他們不切斷DNA或切除堿基而是直接實施修復，這樣的損傷修復機制稱為直接修復。 DNA損傷之一的胸腺嘧啶二聚體可以通過直接修復機制修復。胸腺嘧啶二聚體是紫外線輻射造成的，光激活酶可以結(jié)合胸腺嘧啶二聚體引起的扭曲了的雙螺旋部位。在可見光存在下，光激活酶催化兩個胸腺嘧啶堿基再生，正常的A-T堿基對重新形成，然后光復活酶從已修復好的DNA上脫

22、落。,通過光復活酶修復胸腺嘧啶二聚體的過程,B. 核苷酸切除修復 修復酶是由基因uvrA、uvrB和uvrC分別編碼的三個亞基組成的，所以該酶又稱為ABC切除核酸酶。 首先ABC切除核酸酶從損傷部位的兩側(cè)切去含有損傷的DNA鏈，結(jié)果都出現(xiàn)一個單鏈缺口。然后在DNA聚合酶催化下按照互補鏈填充缺口，切口最后通過DNA連接酶連接。,C. 堿基切除修復 DNA糖基化酶是一個能識別DNA中象尿嘧啶、次黃嘌呤和黃嘌呤那樣的不正確堿基的酶，這些堿基都是由胞嘧啶、腺嘌呤和鳥嘌呤分別脫氨形成的。這樣變型的堿基可以通過DNA糖基化酶切斷N-糖苷鍵除去，這樣一來在DNA中制造了脫嘌呤或脫嘧啶的部位，通常將這樣的部位

23、稱之AP位點。 每種DNA糖基化酶通常對一種類型的堿基損傷特異。例如尿嘧啶糖基化酶就可以除去由于胞嘧啶脫氨形成的尿嘧啶，形成一個AP位點。然后一個稱為AP內(nèi)切核酸酶切去含有AP位點的脫氧核糖-5-磷酸，出現(xiàn)一個核苷酸空隙。然后在DNA聚合酶作用下重新放置一個正確的核苷酸，最后通過DNA連接酶將切口封閉。,尿嘧啶糖基化酶系統(tǒng)的修復過程,D. 錯配修復 偶爾錯誤的DNA復制會導致新合成的鏈與模板鏈之間的一個錯誤的堿基配對。這樣的錯誤可以通過E.coli中的3個蛋白質(zhì)（MutS、MutH和MutL）校正。該修復系統(tǒng)只能校正新合成的DNA，其主要依據(jù)是新合成的鏈中GATC序列中的A（腺苷酸殘基）開始未

24、被甲基化。GATC中A甲基化與否常用來區(qū)別新合成的鏈（未甲基化）和模板鏈（甲基化）。這一區(qū)別很重要，因為修復酶需要識別兩個核苷酸殘基中的哪一個是錯配的，否則如果將正確的核苷酸除去就會導致突變。未甲基化的GATC序列不需要緊靠著錯配堿基，因為錯配堿基與GATC序列之間的間隔的DNA序列可以被外切核酸酶切除，是從3還是從5方向切除取決于不正確堿基的相對位置。,錯配修復,E. DNA的重組修復,胸腺嘧啶二聚體,復制,核酸酶及重組蛋白,修復復制,DNA聚合酶,DNA連接酶,重組,重組修復(recombination repairing)： 這是DNA的復制過程中所采用的一種有差錯的修復方式。,F. S

25、OS修復： 這是一種在DNA分子受到較大范圍損傷并且使復制受到抑制時出現(xiàn)的修復機制，以SOS借喻細胞處于危急狀態(tài)。 DNA分子受到長片段高密度損傷，使DNA復制過程在損傷部位受到抑制。 損傷誘導一種特異性較低的新的DNA聚合酶，以及重組酶等的產(chǎn)生。 由這些特異性較低的酶繼續(xù)催化損傷部位DNA的復制，復制完成后，保留許多錯誤的堿基，從而造成突變。,SOS反應的機制,未誘導的細胞,靶基因,lexA基因被LexA 蛋白質(zhì)部分阻遏,recA基因被LexA 蛋白質(zhì)部分阻遏,（40個不同的位點被阻遏）,LexA(阻遏物),RecA(輔蛋白酶),第三節(jié) DNA的突變,DNA分子中的核苷酸序列發(fā)生突然而穩(wěn)定的

26、改變，從而導致DNA的復制以及后來的轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物隨之發(fā)生變化，表現(xiàn)出異常的遺傳特性，稱為DNA的突變。它包括由于DNA損傷和錯配得不到修復而引起的突變，以及由于不同DNA分子之間的交換而引起的遺傳重組。,二、誘變劑的作用(自修) 堿基類似物(base analog) 堿基修飾劑(base modifier) 嵌入染料(intercalation dye) 紫外線(ultraviolet)和電離輻射(ionizing radiation),一、突變的類型 堿基對的置換(substitution) 移碼突變(framesshift mutation),要點歸納,1. DNA復制是半保留復制，半保留復制已經(jīng)經(jīng)Meselson-Stahl實驗證實。在半保留復制方式中兩條親代鏈分開，分開后的每一條鏈都可作為模板用于合成互補的、反平行的子鏈。就是說雙螺旋子鏈中有一條鏈來自親代鏈，另一條鏈則是以該親代鏈為模板新合成的互補鏈。 2. DNA合成需要DNA聚合酶， DNA聚合酶需要一個游離的3羥基作為引物（可以由RNA或DNA提供），以脫氧核苷三磷酸作為底物，催化 3羥基與脫氧核苷三磷酸的5-磷酸基團形成磷