1、擬南芥葉片總RNA提取,2020/9/14,擬南芥,擬南芥是一種細長而直立的植物，羽狀多葉，莖高度達40厘米。二年生草本，基生葉有柄呈蓮座狀，葉片倒卵形或匙形；莖生葉無柄，披針形或線形?？偁罨ㄐ蝽斏?，花瓣4片，直徑約3毫米，白色，匙形，雄蕊6枚，花藥黃色，雌蕊圓柱狀，花柱短，柱頭凹陷；果實豆莢形，長11.5厘米，薄，輕微向上彎曲，成熟時開裂；果瓣有1中脈及側脈；種子12行，呈卵形，長約1毫米，成熟時紅褐色；子葉背倚胚根?；ㄆ?5月。,2020/9/14,擬南芥是在植物科學，包括遺傳學和植物發(fā)育研究中的模式生物之一。其在農業(yè)科學中所扮演的角色正彷佛小鼠和果蠅在人類生物學中的一樣。盡管擬南芥在農業(yè)

2、上并無多少直接的貢獻，但其優(yōu)點使其成為研究有花植物的遺傳、細胞、分子生物學的典型。擬南芥基因組之小有利于基因定位和測序。其基因組大約為12,500萬堿基對和5個染色體，在植物中算是小的。在2000年，擬南芥成為第一個基因組被完整測序的植物。在探明至今已發(fā)現的25,500個基因的功能上已作出了非常多的工作。 植株之小于生活周期之短同樣也是擬南芥的優(yōu)點。實驗室常用的許多品系，從萌芽到種子成熟，大約為六個星期。植株之小方便其在有限的空間里培養(yǎng)，而單個植株能產生幾千個種子。此外，其自花傳粉的機制也有助于遺傳實驗。 所有這些都使擬南芥成為遺傳研究的模式生物。,2020/9/14,RT-PCR,RT-PC

3、R是將RNA的反轉錄和cDNA的聚合酶鏈式擴增相結合的技術。首先經反轉錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。RT-PCR技術靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆 特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉錄的RNA產物。無論使用何種RNA，關鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組 DNA的污染。,2020/9/14,RNA提取的常見問題,RNA降解 OD260/OD280比值偏低 RNA含有DNA污染 RNA提取量偏低 提取的RNA不溶 下游實驗效果不佳,2020/9/14,RNA降解,使用

4、的組織材料不夠新鮮。提取RNA的組織材料應采用新鮮的組織材料，或將新鮮的組織材料用液氮迅速冷凍后置于-80保存。 提取RNA時使用的試劑及器材中混有RNA分解酶。 提取的組織材料中含有大量的RNA分解酶，而RNAiso Plus的添加量不夠,2020/9/14,OD260/OD280比值偏低,樣品裂解時加入的RNAiso Plus量偏少，造成蛋白變性不充分，可以再次對RNA溶液進行苯酚/氯仿抽提，以除去蛋白。 含有裂解液的樣品經勻漿混勻后未在室溫靜置，或靜置的時間不足5分鐘。 相分離后，吸取上清液時不小心接觸蛋白層造成污染。 RNA未充分溶解。,2020/9/14,RNA中含有DNA污染,裂解組織或細胞使用的RNAiso Plus量偏少。 使用的組織材料中含有大量的有機溶劑（如：乙醇、異丙醇等）、高濃度的Buffer、堿性溶劑等。 如果提取的RNA中含有DNA時，可以使用DNase I進行DNA消化。,2020/9/14,RNA提取量偏低,向組織材料中加入RNAiso Plus后，充分研磨勻漿使其充分裂解。 相分離后請盡量完全回收上清液。,2020/9/14,提取的RNA不溶,75%乙醇清洗沉淀后不要干燥時間過長或加熱干燥。 RNA沉淀中含有不溶的蛋白質混合物時，應注意在相分離后吸取上清液時，避免槍頭接觸蛋白層。,2