1、電泳技術介紹,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE),基本原理,1.SDS能斷裂分子內和分子間氫鍵，破壞蛋白質的二級和三級結構，強還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂。 2.蛋白質樣品在100用SDS和還原劑處理，可解聚成亞基,加入SDS，改變了蛋白質的構象。 3.各種SDS-蛋白質復合物均帶相同密度的負電荷，其荷電超過了原蛋白質，消除了不同蛋白質的荷電差異。,圖解,多孔凝膠,混合大分子,電泳,操作流程,制膠,上樣,電泳,染色,脫色,制膠 1將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干，把玻璃板在灌膠支架上固定好 2 按照配方制

2、備分離膠，TEMED在灌膠前加入混勻，迅速灌膠 3 在分離膠上迅速并輕柔的加上水或無水乙醇進行水封（凝膠聚合好的標志是膠與水層之間形成清晰的界面） 4 倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干,按比例配好濃縮膠,連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣5mm處,迅速插入樣梳,靜置40分鐘,具體步驟,上樣 按一定順序在加樣孔中加入樣品，根據SDS-PAGE電泳玻璃板 間隙厚度不同，選擇加入樣品量。 電泳 打開電源將電壓調到80v（一般15min左右），待樣品跑過壓 縮膠后將電壓調到120v至樣品電泳到膠底部為止。,染色 將凝膠小心取下放入容器中，加入染色液（考馬斯亮藍 ），用搖床搖23h 脫色 待條帶清晰后倒出染色液，

3、加入脫色液過夜。將脫色液倒掉 ，可以用Quality One，或者相應的成像系統(tǒng)拍照、分析、 估算蛋白濃度。,等電聚焦電泳 (Isoelectro focusing IEF or EF),等電聚焦電泳 ，是利用有pH梯度的介質分離等電點不同的蛋白質的電泳技術。由于其分辨率可到達0.01pH單位，因此特別適合于分離分子量相近而等電點不同的蛋白質組分。 適用: 1.研究蛋白質微觀不均一性 2.測定蛋白質等電點,基本原理,Company Logo,用電流在凝膠溶液中建立一個穩(wěn)定的PH梯度,蛋白質移動到它們各自的等電點，不同等電點的蛋白質被分開,Company Logo,pH梯度構建,載體兩性電解質p

4、H梯度 (Carrier ampholytes pH gradients，CA):在電場中通過兩性緩沖離子建立的pH梯度。 固相pH梯度（immobilized pH gradients，IPG） 將緩沖基團共價鍵合在介質上成為凝膠介質的一部分而建立pH梯度（線性和非線性），分辨率比前者高一個數量級。,載體兩性電解質（CA）應具備的條件,(1)在等電點處必需有足夠的緩沖能力 (2)在等電點必需有足夠高的電導 (3)分子量要小，便于與被分離的高分子物質用透析或凝膠過濾法分開。 (4)化學組成應不同于被分離物質，不干擾測定。 (5)應不與分離物質反應或使之變性。,操作流程,1,2,3,4,制膠,裝

5、管,裝槽，電泳,剝膠,5,固定,測定pH梯度,具體步驟,1. 配膠 2. 裝管 每個學生裝兩支管，每組裝四支。先用肥皂洗手，然后將圓 盤電泳槽的玻璃管洗凈，底端用塑料薄膜和橡皮筋封口，垂 直放在試管架上，用移液管將配好的膠液移入管內，（每根 玻璃管的容量約為1.5-1.8ml）,液面加至距管口1mm處，用 注射器輕輕加入少許H2O，進行水封，以消除彎月面使膠柱 頂端平坦。膠管垂直聚合約30分鐘，聚合完成時可觀察到水 封下的折光面。,3. 裝槽和電泳 用濾紙條吸去膠管上端的水封，除去下端的薄膜，水封端向上，將膠管垂直插入圓盤電泳槽內，調節(jié)好各管的高度，記下管號。每支管約1/3在上槽，2/3在下槽

6、。上槽加入500ml 0.1M H3PO4，下槽加入500ml 0.1M NaOH，淹沒各管口和電極，用注射器或滴管吸去管口的氣泡。上槽接正極，下槽接負極，開啟電泳儀，恒壓160V，聚焦2至3小時，至電流近于零不再降低時，停止電泳。,4. 剝膠 取下膠管，用H2O 將膠管和兩端洗2次，用注射器沿管壁輕 輕插入針頭，在轉動膠管和內插針頭的同時分別向膠管兩端 注入H2O少許，膠條即自行滑出，若不滑出可用洗耳球輕輕 擠出。膠條置于小培養(yǎng)皿內，記住正極端為“頭”，負極 端為“尾”，若分不清時，可用pH試紙鑒定，酸性端為正，堿 性端為負。,5. 固定 取2支膠條置于一個小培養(yǎng)皿內，倒入10%三氯乙酸溶液

7、至沒過膠條，進行固定，約半小時后，即可看到膠條內蛋白質的白色沉淀帶。固定完畢，倒出固定液，用直尺量出膠條長度“L2”和正極端到蛋白質白色沉淀帶中心（即聚焦部位）的長度“L”。 固定后的膠條可在康強860紫外/可見分光光度計上用280nm或238nm波長作凝膠掃描，然后用掃描圖作相應的測量和計算。,6. 測定pH梯度 將放在另一個培養(yǎng)皿內未固定的膠條，用直尺量出待測pH膠條的長度“L1”。按照由正極至負極的順序，用鑷子和小刀依次將膠條切成10mm長的小段，分別置于小試管中，加入1ml H2O，浸泡半小時以上或過夜，用仔細校正后的帶細長pH復合電極的pH計測出每管浸出液的pH值。,優(yōu)缺點,優(yōu)點：分

8、辨率高，區(qū)帶清晰、窄，加樣部位自由，重現性好，不僅可測定蛋白或多肽的等電點而且能將不同等電點的混合生物大分子進行分離和鑒定 。 缺點：需無鹽溶液，不適用于在等電點不溶解或發(fā)生變性的蛋白。,雙向電泳 （2-D electrophoresis）,Company Logo,基本原理,第一向進行等電聚焦，蛋白質沿pH梯度分離（將適宜的IPG試劑添加至混合物中用于凝膠聚合，在聚合中緩沖基團通過乙烯鍵共價聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度），至各自的等電點；隨后，再沿垂直的方向進行分子量的分離。,第一向：等電聚焦電泳,第二向：SDS-PAGE,水平方向：反映出蛋白在pI上的差異 垂直方向：反映出它們在分

9、子量上的差別,圖解,2D電泳操作流程,挖點 酶解 點靶,蛋白鑒定,分離,雙向電泳 第一向 第二向,圖譜分析,圖像獲取 圖譜分析,1.樣品制備 2.固相預制膠條的水化 3.第一向等電聚焦 3.1. 取出IPG預制膠條（7cm pH 4-7），室溫平衡。 3.2. 在聚焦盤或水化盤中加入樣品。 3.3. 去除預制IPG膠條上的保護層 。,具體步驟,3.4. 將IPG膠條置于聚焦盤或水化盤中 。 3.5. 在每根膠條上覆蓋1ml礦物油。 3.6. 對好正、負極，蓋上蓋子。 3.7. 設置等電聚焦程序。 4.膠條的平衡 4.1冰箱中取出的膠條，于室溫放置10分鐘。,4.2配制膠條平衡緩沖液 I 。 4.3吸去膠條上的礦物油及多余的樣品。 4.4第一次平衡。振蕩15分鐘。 4.5配制膠條平衡緩沖液 II 。 4.6第二次平