1、第六章 穩(wěn)定性同位素示蹤法 概述： 1、1912年，Thomson首發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定性核素20Ne和22Ne（氖）。 2、1929年，Naude發(fā)現(xiàn)了15N。 3、1937年，Urey等首次報(bào)道人工生產(chǎn)15N的方法。 4、1940年，先后獲得具生物意義的15N、18O和3H大量生產(chǎn)。,5. 1947年9月在美國Wisconsin大學(xué)召開了“同位素在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中應(yīng)用”專題討論會(huì)，從此開始了穩(wěn)定性核素示蹤技術(shù)應(yīng)用的新紀(jì)元。 6. 近20年，穩(wěn)定性核素示蹤技術(shù)迅速發(fā)展，分離分析方法取得了較大突破，13C、2H、18O、15N廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、環(huán)保、農(nóng)藥、農(nóng)學(xué)、微生物等研究領(lǐng)域。我國先后分離了25種元

2、素的100多種穩(wěn)定性核素，例如：15N標(biāo)記化合物就有30余 種。,幾個(gè)概念 穩(wěn)定性同位素（Stable isotope） 豐度（Abundance） A 即某核在該組同位素中濃度(通常指人工加濃了 的)。 自然豐度（Natural abundaa） A自(AO) 15N：0.365%、18O:0.204% 原子百分超（Atom percent excess） a a = A-A自 又稱富集度（Enrichment） 富集15N（Enriched15N） 貧化15N（Depeled15N ),一.穩(wěn)定性同位素示蹤法的基本依據(jù)： 1.自然界中一種元素同位素組成是相對(duì)恒定 2.同一元素的同位素具有相

3、同的化學(xué)性質(zhì) 3.同一元素的同位素之間存在質(zhì)量差異,重要化學(xué)元素的穩(wěn)定性同位素 元素 同位素 自然豐度 樣品來源 H 1H 99.985 新鮮的表面淡水 2 H(D) 0.0147 B 10B 18.46 意大利天然硼酸鹽 11B 81.54 C 12C 98.892 捷克撲利茲石灰石 13C 1.108 N 14N 99.635 大氣中的氮?dú)?15N 0.365 O 16O 99.759 大氣中的氧氣 17O 0.0374 18O 0.2039,氮的同位素表 同位素 射線種類 半衰期 自然豐度 12N + 0.011S 13N + 9.96m 14N - - 99.635 15N - - 0

4、.365 16N - 7.1S 17N - 4.15S 18N - 0.63S,穩(wěn)定性同位素標(biāo)記物的命名 1978年國際純化學(xué)和化學(xué)聯(lián)合會(huì)IUPAC的命名法: 結(jié)構(gòu)式: 15NHCl 或15NHCl（這樣純的物質(zhì)不存在) 單標(biāo)記化合物: H215N-CO-NH2 15N-尿素，例如15N的豐度可為5%，10%，15% 雙標(biāo)記化合物(一個(gè)同位素): H215N-CO-15NH2尿素 4. 混合標(biāo)記化合物: ( 15NH2)13CO (13C15N)尿素,核素 A（%） 質(zhì)量數(shù) 14N 99.635 14 15N 0.365 15 注意：由于同位素之間的質(zhì)量差異，因此它們的物理、化學(xué)、生物化學(xué)等性

5、質(zhì)會(huì)有所不同，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，需注意同位素效應(yīng)。,二. 穩(wěn)定性同位素示蹤法的特點(diǎn)： 1.無放射性，無輻射效應(yīng)及不良影響。 2.安全、對(duì)人無傷害。 3.無污染，不受環(huán)境條件限制。 4.無衰變，實(shí)驗(yàn)時(shí)間不受限制。 5.可進(jìn)行放射性示蹤法難以進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。 例：N素中T最長的13N：T=9.096m,一 三. 穩(wěn)定性同位素分析法的基本流程 同位素引入生物體 動(dòng)植物原始樣品 儀器所需的待測樣品,進(jìn)樣過程 質(zhì)譜分析法 光譜分析法 記錄 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,四 .影響15N引入豐度的因素 1.實(shí)驗(yàn)材料對(duì)15N的稀釋程度。 2.N素在不同部位分布的不均勻性 3.分析測定技術(shù)所能達(dá)到的精度。,15N示蹤法引入N素肥料的豐

6、度計(jì)算 參考公式 af = Wp Rp ap/Nf RN 式中： af：N素肥料的原子百分超 Wp：植物總重量（待測） ap：植物樣品中原子百分超 Rp：植物樣品中含N百分率,Nf：施純N量 RN：N肥利用率,注意事項(xiàng)： 1.同位素交換反應(yīng)：在一定條件下，標(biāo)記的銨鹽可與大氣發(fā)生反應(yīng)： 15NH+4水溶液+14NH314NH+4水溶液+15NH3 15N豐度高時(shí)應(yīng)注意。 2.同位素效應(yīng)：藻類對(duì)14C、13C、12C的吸收依次遞減。 3.予測樣品測定項(xiàng)目,五、質(zhì)譜和光譜測定15N原理 14N和15質(zhì)量不同 質(zhì)譜：把N2離子化為28N-N2，29N-N2 ，30N-N2 使其 在均勻磁場中發(fā)生不同角

7、度偏轉(zhuǎn) 2 光譜：28N-N2：譜線波長為2976.8埃 29N-N2：譜線波長為2982.9埃 30N-N2：譜線波長為2988.6埃 -,入口,出口,加速電壓,1800的均勻磁場,六.供儀器待測樣品的制備、測量 1.對(duì)待測樣品的要求： (1) 因?yàn)闇y量的是不同質(zhì)量離子流的相對(duì)含量，因此，保證有一定的N量即可。一般要求含N量1mg/ml最少不低于0.5mg。 (2) 儀器的本底檢查。 (3)離子峰的選擇（14N和15N的峰比28N、29N小10倍，選28N、29N、30N）。 (4) 儀器精確度檢查（檢查去O2后的空氣或純N氣）。,2.分析樣品的制備： (1) K氏法（Kjeidali） 質(zhì)

8、譜分析常用法。,A.樣品的消化：（例：0.05g植樣+10ml濃H2S04+3.3gSe:CuSO4:K2SO4為1:10:100混合催化劑樣液清亮再消煮5h（土）或2h(植)，溫度120-140。樣品予處理：水楊酸硫酸法：5g干土或0.5g植樣+12ml水楊酸：硫酸為50g：1000ml溶液中放置30min，再加2.5g硫代硫酸鈉和15ml水，緩緩加熱至停出起泡冷卻常規(guī)消化）。,B.蒸餾： 用蒸汽蒸餾將消化液中NH3分離出來，并測定總N。 方法：消化液中加過量40%NaOH,釋放的NH3被蒸汽逐出，經(jīng)冷凝后被2%硼酸吸收，加入混合指示劑用標(biāo)準(zhǔn)硫酸滴定（設(shè)置一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液）。 此步驟將NH3-N轉(zhuǎn)

9、變成了NH4+-N（銨態(tài)N），儀器分析適宜量1mgN/樣品2-3ml(濃縮或稀釋)。 (制備好的樣品送交儀器分析),以下在質(zhì)譜儀上進(jìn)行 C.將NH4+-N轉(zhuǎn)化為N2氣 : 在真空條件下，將上述樣品與次溴酸鈉反應(yīng)，放出N氣（在質(zhì)譜儀內(nèi)進(jìn)行）詳見書15N章節(jié)。,制樣時(shí)注意： 1.所有試劑純度要高。 2.消化要完全。 3.防止樣品間交叉污染（每個(gè)樣品蒸餾前用蒸餾15ml乙醇洗器皿）。 4.“Y”型管及內(nèi)部反應(yīng)抽氣須徹底，防其它氣體干擾。,以下在光譜儀上進(jìn)行,可用液體樣品也可用干樣品 (2).杜馬法（Dumas） 光譜分析中常用法 適用于含N量低（少于100 g）的樣品，光譜測量。,方法： A在放電管

10、中裝入樣品，氧化劑（CuO）及吸收劑（CaO）抽真空，抽完后熔封放電管。 在馬福爐中燃燒0.5-3h（560）樣品，（CaO吸收CO2和H2O)以產(chǎn)生N2氣。 B冷卻至室溫后在光譜儀上測定 純樣品火焰為粉紅色或淡黃色 有CO2呈白色，有水呈黃色）,注意： 如果是液體樣品。需用Pyrex玻璃管（1cm 2mm）吸滿樣液，烘干后再放入放電管。 CuO、CaO使用前用700高溫烘干除去CO2，H2O，并在12-18Kg/cm2壓力下制成棒狀,備光譜分析,儀器分析方法步驟： 1、通電予熱儀器10分鐘，打開光電倍增管高壓。 2、放電管裝入燃燒室固定架上。 3、開高頻發(fā)生器電源，使放電管中樣品放電發(fā)光。

11、4、選擇適宜放大倍數(shù)對(duì)28N、29N、30N峰分別進(jìn)行放大，在2970A0-2990A0之間掃描。 5、放下記錄筆，接通掃描開關(guān)，劃出28N、29N、30N峰高。 6、求得平均峰高，計(jì)算15N豐度。,七15N實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算 14、15的質(zhì)量比28、29、30的小10倍， 不參加運(yùn)算 當(dāng)15N豐度小于5%: R = 質(zhì)量為28離子流強(qiáng)度/質(zhì)量為29離子流強(qiáng)度 此時(shí)30N的流子離強(qiáng)度很小，,1.豐度：A = 1/2R+1100% (1),當(dāng)15N豐度大于5% R=質(zhì)量為29離子流強(qiáng)度/質(zhì)量為30離子流強(qiáng)度 A = 2/R+2 100% 或者由質(zhì)量為28、29、30的峰值直接算出： A= 29+230

12、/2（28+29+30)100%,以下以植物材料實(shí)驗(yàn)為例進(jìn)行計(jì)算，其計(jì)算原理也適用于動(dòng)物等，共同的條件是在一個(gè)相對(duì)封閉系統(tǒng)內(nèi)開展實(shí)驗(yàn)。（若是用32P等實(shí)驗(yàn)，計(jì)算時(shí)把原子百分超換成比強(qiáng)度即可） 2.植樣的原子百分超: ap ap = A-A自 （2） （A自= 0.365%或空白實(shí)驗(yàn)值）,3.植物從肥料中攝取N的%: Ndff 植物中N有多少%是來自于肥料（Percentage of in the plant derived from the fertilizer），可以是根、莖、葉、果實(shí)的任一Ndff Ndff = ap/af100% （設(shè)N素來源于土壤和肥料二方面） （3） af：肥料N的原

13、子百分超（或動(dòng)物飼料N的原子百分超，此時(shí)又多了一個(gè)動(dòng)物排泄因素）。,上片解釋見第五章第37片同位素稀釋法,4、植物從土壤中攝取N的%（Percentage of in the plant tissue derived from the soil）:Ndfs Ndfs =1- Ndff (4) 5、植物中來自肥料的N量: Npf Npf=植物總N量ap/af （5） Npf+Nps=植物中總N量（已在定N中測定, K氏定N法）設(shè)總N來源于土壤和肥料，則：,6.植物中來自土壤N的量：Nps Nps = 總N - Npf (6) 7.N素利用率：R = Npf / Nf100% (7) Nf：施入純

14、N的總量 8.土壤A值：A值 =Ndfs / NdffNf (Kg/公頃) （8） A值：表示土壤有效供應(yīng)N素量(用A值可以解釋為什么某種土壤適合于種植某種植物)。 (來自：A值/Ndfs=Nf/Ndff),9、N素回收率： R回 = 已檢出的Nf量 / Nf100% (9) 10、N素?fù)p失率： R失 = 100% - R回 (10) 以上公式適用32P等放射性物質(zhì)（以比強(qiáng)為單位）等計(jì)算。,練習(xí)題： 蕃茄實(shí)驗(yàn)地中施用15N-尿素純N20Kg/畝，收獲后測得植物含N量為30Kg/畝，植物樣品的15N豐度為0.67%，15N-尿素的15N豐度為1.37%，設(shè)自然豐度為0.37%，尿素的含N量為40

15、%。 求：1、每畝施入尿素量？2、肥料N素的利用率？ 3.A值? 解： ap = 0.67-0.37 = 0.3% af = 1.37-0.37 = 1.0% Ndff = ap/af = 0.3/1.0 = 30% Npf = NpNdff = 30Kg/畝30% = 9Kg/畝 施入尿素量：W = 20/40% = 80Kg/畝 肥料N素利用率：R = Npf/Nf= 9/20 = 45% A值=Ndfs/NdffNf=70%/30% 20Kg/畝=46.7Kg/畝（土壤中可供蕃茄生長的每畝有效N-當(dāng)然不是全部被吸收,A值愈大說明土壤的供N能力愈強(qiáng)）,下列研究方法： 1. 測根瘤數(shù)目和干物

16、質(zhì)產(chǎn)量。早、有無？ 2. 氮素平衡法。十分煩瑣。 3. 比較固N(yùn)作物和非固N(yùn)作物總N量差異。 4. 乙炔還原法。簡單、靈敏。 5.乙炔還原成乙烯，存在轉(zhuǎn)換因子（3個(gè)）。,15N示蹤與生物固氮(以下各方法簡講) 工業(yè)固氮（Haber-Bosch反應(yīng)）：N2+3H2 催化劑/45，200在氣壓 2NH3 生物固氮：N2+6H+xATP 6e-/固氮酶 2NH3+xADP+xPi,6. 同位素法： 15N2還原法（Burris,1941）:充15N2密室進(jìn)行 NdfA=a樣/a氣100% 固氮量=NdfA總N量 同位素稀釋法（J、O、Legg等，1975），15N施入土壤 NdfA=1- a固/a非

17、 AN值法（M、Fried等，1975），田間種固N(yùn)、非固N(yùn) NdfA=(As + Afix - As) NdfF/Af As、Af、Afix分別代表土壤、肥料、大豆有效N量。 NdfF:來自肥料N素的比例。,八、 13C示蹤法 1樣品的制備： （1）樣品碳轉(zhuǎn)化為BaCO3：干氧化法（Pregl）: 如上圖 濕氧化法（Weinhouse 1948） (2）BaCO3CO2轉(zhuǎn)化：BaCO3+0.5%HCl:飽和NaCl(1:4)(真空、冷卻),2測量：CO2在質(zhì)譜中經(jīng)電子轟擊產(chǎn)生多種分子離子和原子離子。 13C%=1/R+1100% R=45/44 其中：45示（13C16O16O）+和（12C16O17O）+，44示12C16O16O+（m/e）, （12C16O17O）+可用校正峰解決。,九. 18O示蹤法： 樣品制備：也是轉(zhuǎn)化成CO2，很少用O2、N2O2、NO2。 如：平衡法：H218O+C16O2=H216O+C18O2 碳酸鹽