1、1,第十四章 溶菌酶,2,食品的防腐保鮮始終是食品領域一個亟待解決的重要問題 微生物是導致食品腐爛變質的罪魁禍首 最有效的解決辦法添加食品防腐劑 目前使用最多的化學防腐劑 天然食品防腐劑溶菌酶的研發(fā)成為熱點,問題的提出,3,EC.3.2.1.17，系統(tǒng)名為：N-乙酰胞壁質聚糖水解酶 簡稱胞壁質酶 溶菌酶的研究最早是從尼科爾(Nicoile)1907年發(fā)表枯草桿菌溶解因子的報告開始的。 兩年后，Laschtschenko指出：雞卵白強烈抑菌作用是酶作用的結果。 1922年英國細菌學家A.Fleming發(fā)現(xiàn)人的唾液、眼淚中存在有溶解細菌細胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名為溶菌酶。Lysozyme

2、（LZM）,4,一、溶菌酶的來源于分布,廣泛存在于人體多種組織中，鳥類和家禽的蛋清； 哺乳動物的淚、唾液、血漿、尿、乳汁等體液； 微生物； 以蛋清含量最為豐富。,5,溶菌酶的含量比較,來源不同的溶菌酶，活性不同。其中，以人溶菌酶的活性最高，分別是蛋清溶菌酶的3倍，牛乳溶菌酶的3000倍（K.J.Losnedahl，1998） 。,蛋清，植物，微生物發(fā)酵,6,二、性質及作用機理,性質： 溶菌酶純品為白色或微黃、黃色的結晶體或無定型粉末；無異味，微甜；易溶于水；遇堿易被破壞；在酸性pH下穩(wěn)定，此時100的加熱對溶菌酶僅有很小的活性損；，不溶于乙醚。,7,抗菌機理,細菌的細胞壁由胞壁質組成，胞壁質是

3、由N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamineNAG)及N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acidNAM)交替組成的多聚物，胞壁酸殘基上可以連接多肽，稱為肽聚糖(Peptidoycan)。,8,肽聚糖是由NAM、NAG和肽“尾”(一般是4個氨基酸)組成，NAM與NAG通過-l，4糖苷鍵相連，肽“尾”則是通過D-乳酰羧基連在NAM的第3位碳原子上，肽尾之間通過肽“橋”(肽鍵或少數(shù)幾個氨基酸)連接，NAM、NAG、肽“尾”與肽“橋”共同組成了肽聚糖的多層網(wǎng)狀結構，作為細胞壁的骨架。,9,溶菌酶的功能圖示,肽鏈中Glu35和Asp52所構成的活性中心,LZM,10,專一地

4、作用于細菌細胞壁肽多糖分子中NAM與NAG之間的-1,4鍵，從而催化細菌細胞壁中的肽多糖水解，破壞細菌的細胞壁，使細菌溶解死亡 溶菌酶還可與帶負電荷的病毒蛋白直接結合，與DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復鹽，使病毒失活。 因此，該酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。,11,對于G+細菌與G-細菌，其細胞壁中肽聚糖含量不同，G+細菌細胞壁幾乎全部由肽聚糖組成，而G-細菌只有內(nèi)壁層為肽聚糖，因此，溶菌酶只能破壞G+細菌的細胞壁，而對G-細菌作用不大。,12,三、溶菌酶的種類,根據(jù)來源不同，將溶菌酶分為四類 動物源溶菌酶： 雞蛋清溶菌酶、 人和哺乳動物溶菌酶 植物源溶菌酶 微生物源溶菌酶 噬菌體源溶菌酶,

5、13,常見的幾種溶菌酶,1、蛋清溶菌酶-保鮮中應用最多 雞蛋清溶菌酶占蛋清總蛋白的3.4%3.5%，作為溶菌酶類典型代表，是目前重點研究對象，也是了解最清楚溶菌酶之一。 從雞蛋清中提取分離的溶菌酶是由18種129個氨基酸殘基構成的單一肽鏈。 它富含堿性氨基酸，有4對二硫鍵維持酶構型，是一種堿性蛋白質，其N端為賴氨酸，C端為亮氨酸。,14,四條多肽鏈組成。 相對分子量14000 等電點為10.8 最適溫度為50，最適pH值為67。 化學性質非常穩(wěn)定，在pH1.2 11.3范圍內(nèi)劇烈變化時，結構仍穩(wěn)定不變。遇熱也很穩(wěn)定，在pH47、100處理1min不失活，是一種穩(wěn)定的堿性蛋白質，但在堿性條件下對

6、熱穩(wěn)定性較差。 分解G+細菌，但對G-細菌不起作用,15,其它鳥類如鵪鶉、珍珠雞、火雞等的蛋清中也分離純化出溶菌酶； 與雞蛋清溶菌酶活性非常相似，也由129個氨基酸組成，雖排列順序有所不同，活性部位也不相同，但活性部位的氨基酸排列則大體相同 。,16,2、人及哺乳動物溶菌酶,人溶菌酶存在于眼淚、唾液、鼻粘液、乳汁等分泌液以及淋巴腺、白血球、肝、腎、淋巴組織中，1ml眼淚中含7mg溶菌酶，1ml乳汁中含0.10.5mg。 人溶菌酶由130個氨基酸殘基組成，有4個S-S鍵，分子量為14600，其溶菌活性比雞蛋清溶菌酶高2倍。 對于哺乳動物溶菌酶，目前已從牛、豬、貓、兔、猴、馬、羊等動物的乳汁中分離

7、出溶菌酶，其化學性質與人溶菌酶相似，但結構尚不清楚，其溶菌活性也遠低于人溶菌酶約3000倍。 曾林（1999）采用瓊脂平板法測定家兔初乳溶菌酶含量。結果表明：初乳溶菌酶含量為（7.962.01）g/ml，常乳溶菌酶含量(5.011.32)g/ml。人及哺乳動物溶菌酶的作用機制與雞蛋清溶菌酶相同。,17,3、植物溶菌酶,目前已從木瓜、無花果、蕪菁、大麥等植物中分離出溶菌酶，其分子量較大，約為2400029000。 植物溶菌酶對溶壁小球菌的溶菌活性不超過雞蛋清溶菌酶的1/3，但對膠體狀甲殼質的分解活性則是雞蛋清溶菌酶的10倍。 周澤文（1994）從菜心分離溶菌酶表明，酶比活力達3414.6U/mg

8、，純化倍數(shù)為197.4。 菜心溶菌酶在較寬的溫度和pH植范圍內(nèi)均有活性，最適溫度為60，最適pH值為5.8。,18,高向陽（1997）研究了蘿卜溶菌酶對白色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿3種革蘭氏陽性菌和變形菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏桿菌、多殺巴斯德氏桿菌、雛白痢沙門氏菌、產(chǎn)氣桿菌6種革蘭氏陰性菌及釀酒酵母、總狀毛霉、黑根霉、黑曲霉、青霉5種真菌的抑菌效果。 同時還研究了蘿卜溶菌酶對白菜軟腐病菌、柑橘潰瘍病菌、番茄青枯病菌、水稻細條病菌、水稻白葉枯病菌及煙草青枯病菌6種植物病原細菌的抑菌效果。 試驗證明：蘿卜溶菌酶對上述參試的菌種都有不同程度的抑菌作用。,19,4、微生物產(chǎn)生的溶菌酶,根據(jù)其

9、作用對象分為兩類： 細菌細胞壁溶菌酶 真菌細胞壁溶菌酶,20,細菌細胞壁溶菌酶可分為三大類： N-乙酰氨基己糖苷酶：破壞細菌細胞壁肽聚糖中-(1，4)糖苷鍵 酰胺酶：催化裂解細菌細胞壁肽聚糖中N-乙酰胞壁酸與肽“尾”之間的N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸鍵 內(nèi)肽：催化裂解肽聚糖肽橋中的肽鍵,21,現(xiàn)在研究發(fā)現(xiàn)，細菌細胞壁溶菌酶的抗菌活性不僅表現(xiàn)在其分解細菌細胞壁方面，當酶受到不可逆抑制后，它仍然顯示出抗菌效應；不同來源的細菌細胞壁溶菌酶有不同的抗菌范圍，并對不同類型的肽聚糖有特異性。,22,真菌細胞壁溶菌酶：幾丁質酶 和-葡聚糖酶,幾丁質酶 幾丁質酶主要用于真菌細胞壁的降解和重組，但大多數(shù)產(chǎn)幾丁質酶

10、的真菌中，主要用于真菌細胞壁的成型過程， 由于肽聚糖和甲殼質的糖骨架具有相似的結構，一些幾丁質酶也具有溶菌酶活性,23,-葡聚糖酶 -葡聚糖酶主要用于分解酵母細胞的細胞壁。如-(1，3)葡聚糖酶主要作用是它能水解-(1，3)糖苷鍵，還可以對幾丁質降解真菌細胞壁起到顯著的協(xié)同作用 將純化的幾丁質酶和-葡聚糖酶合用，其抗灰色葡萄孢(Botrytis cinera)作用能夠提高10倍,24,5、噬菌體產(chǎn)生的溶菌酶,一種特異性的酶，由噬菌體感染、誘導產(chǎn)生，但未被感染的宿主細胞上不存在該酶。,25,四、溶菌酶的應用過程中體現(xiàn)的優(yōu)點,（1）溶菌酶是很穩(wěn)定的蛋白質，有較強的抗熱性。蛋清溶菌酶是已知的最耐熱的

11、酶； （2）溶菌酶不會因為有機溶劑的處理而失活，當轉移到水溶液中時，溶菌酶的活力可全部恢復； （3）溶菌酶可被冷凍或干燥處理，且活力穩(wěn)定； （4）溶菌酶適宜pH5.36.4，可用于低酸性食品防腐；,26,（5）溶菌酶生產(chǎn)成本較低； （6）溶菌酶的抗菌譜較廣，不僅局限于G+ 菌，對部分G- 菌也有抑制效果； （7）溶菌酶作為防腐劑安全性高。 溶菌酶是一種天然蛋白質，1992年FAO/WTO 的食品添加劑協(xié)會已經(jīng)認定溶菌酶在食品中應用是安全的。,27,五、溶菌酶的應用,溶解微生物細胞壁，對人體細胞無影響。 廣泛應用醫(yī)藥、食品的滅菌領域。 消除炎癥，清除壞死組織等。 食品的防腐保鮮-非加熱的方法。,

12、28,（1）干酪保鮮,在干酪生產(chǎn)中添加一定量的溶菌酶，可以防止微生物污染引起的酪酸發(fā)酵，保證干酪的質量。,29,（2）水產(chǎn)品保鮮,魚蝦等，易腐變質。 冷凍或鹽腌的方法保鮮，但設備要求高，或者鹽腌風味改變。 把一定濃度的溶菌酶噴灑在水產(chǎn)品上，起到防腐保鮮的作用。,30,（3）低濃度釀造酒的保鮮,釀造酒的酒精含量低，微生物可以生長，引起變質。 如清酒酒精含量1517%，大多數(shù)微生物不能生長，但乳酸菌-火落菌，可以生長產(chǎn)生不良風味。,31,水楊酸作為防腐劑，但過多會損害人的胃和肝臟。 加入15mg/kg的溶菌酶，起到防腐作用,32,（4）乳制品的保鮮與強化,Fresh milk含有13mg/ml H

13、uman milk含有40mg/ml 強化溶菌酶，防腐保鮮，人乳化作用。,33,（5）其他食品保鮮,香腸 奶油 保鮮 （生）面條,34,奶油蛋糕是容易腐敗變質的食品之一，在糕點中加入溶菌酶，可防止微生物的繁殖，起到防腐作用。 章銀良研究了溶菌酶對草莓的保鮮作用，發(fā)現(xiàn)將溶菌酶與甘氨酸聯(lián)用，保鮮效果更佳。 由于處于酵母細胞壁中的蛋白質利用率很低，所以利用溶菌酶破壞酵母細胞壁，可制成微生物蛋白質，提高酵母蛋白質的利用率。 用含放線菌體的溶菌酶處理酵母液可生產(chǎn)出含有5-肌苷酸、5-鳥苷酸及其他呈味物質。,35,將溶菌酶固定化在食品包裝材料上，生產(chǎn)有抗菌功效的食品包裝材料，以達到抗菌保鮮功能。目前許多肉

14、制品軟包裝都需要經(jīng)過高溫滅菌處理。經(jīng)過處理的肉制品脆性變差甚至產(chǎn)生蒸煮味。如果在產(chǎn)品真空包裝前添加一定量溶菌酶(1%3%)，然后巴氏殺菌(80100，2530min)，可獲得很好的保鮮效果。,（6）在食品包裝工業(yè)中的應用,36,溶菌酶是一種無毒、無害的高鹽基蛋白質，且具有一定的保健作用，有抗感染和增強抗生素作用效力，促進血液凝固及止血作用，有組織再生作用。因此，可以在保健食品中添加一定量以提高保健效果。,（7）在功能性食品中的應用,37,注意,酶的專一性：對于酵母、霉菌、G-引起的腐敗變質效果不理想。 酶的穩(wěn)定性與有效期。,38,醫(yī)學上應用,一種具有殺菌作用的天然抗感染物質。 有抗菌、抗病毒、

15、止血、消腫止痛及加快組織恢復功能等作用。 臨床用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔潰瘍、水痘、帶狀皰疹和扁平疣等。 也可與抗菌藥物合用治療各種細菌和病毒感染。 口服和肌注均有效。,39,口服，35片/次(腸溶片含10mg)，3次/日?？诤?，1片/次(口含片含20mg)，46次/日。 外用：以1%2%溶液滴注、涂擦或直接噴粉。 肌注，50mg100mg/次，12次/日。 滴眼：用2%溶液。,40,副作用,偶有較輕的過敏反應。 氯化溶菌酶醫(yī)療效果更廣，有濃痰分散、出血抑制、組織修復、消炎鎮(zhèn)痛、抗過濾性病毒等作用； 用氯化溶菌酶的制藥有消炎消痔、治感冒、皮膚病及眼、鼻、喉等用藥.,41,七、溶菌酶的市場行情,溶菌酶是當前在國內(nèi)外非常緊俏的一種生化產(chǎn)品 目前在我國黑龍江、遼寧、天津、北京、河北、河南、山西、山東、湖南、湖北、浙江、江蘇等地均有蛋清溶菌酶生產(chǎn)。但大多數(shù)企業(yè)的生產(chǎn)能力有限，產(chǎn)品質量難以保證，生物活性較低（1,700-5,000u/mg），價格也低廉（2,000-4,000元/公斤）。 國內(nèi)溶菌酶防腐劑產(chǎn)品較少，而日本Q.P.公司于2000年就將其注冊產(chǎn)品LYSOPOWDER P-2推向了市場。,42,溶菌酶 制劑,白色晶體。 堿性蛋白質，等電點 PH10.511.0 。 溶菌酶產(chǎn)品活力 2.0 萬 u/mg 。 溶于稀鹽水，在丙酮和乙醇作用下