1、第四章 微生物的營養(yǎng)和培養(yǎng)基,微生物營養(yǎng)是微生物生理學(xué)重要部分，主要闡明營養(yǎng)物質(zhì)在其生命活動(dòng)中的生理功能及微生物細(xì)胞從外界環(huán)境攝取營養(yǎng)物的具體機(jī)制。,營養(yǎng)物質(zhì):能夠滿足機(jī)體生長、繁殖和完成各種生理活動(dòng)所需要的物質(zhì).,營養(yǎng):微生物獲得和利用營養(yǎng)物質(zhì)的過程。,營養(yǎng)物質(zhì)是微生物生存的物質(zhì)基礎(chǔ)，而營養(yǎng)是微生物維持和延續(xù)其生命形式的一種生理過程。,1.微生物的營養(yǎng)要求 1.1 微生物細(xì)胞的化學(xué)組成 1.2 營養(yǎng)物質(zhì)及其生理功能 1.3 微生物的營養(yǎng)類型(nutritional types) 2.培養(yǎng)基 2.1 選用和設(shè)計(jì)培養(yǎng)基的原則和方法 2.2 培養(yǎng)基的類型及應(yīng)用,主要內(nèi)容,3.營養(yǎng)物質(zhì)如何進(jìn)入細(xì)胞

2、3.1 單純擴(kuò)散(diffusion) 3.2 促進(jìn)擴(kuò)散(facilitated diffusion) 3.3 主動(dòng)運(yùn)輸(active transport) 3.4 基團(tuán)移位(memberane vesicle transport）,1. 微生物細(xì)胞的化學(xué)組成 2. 營養(yǎng)物質(zhì)及其生理功能 3. 微生物的營養(yǎng)類型(nutritional types),第一節(jié) 微生物的營養(yǎng)要求,表微生物和動(dòng)物、植物營養(yǎng)要素的比較,主要元素：碳、氫、氧、氮、磷、硫、鉀、鎂、鈣等,微量元素：鋅、錳、氯、鉬、硒、鈷、銅等,占細(xì)菌細(xì)胞干重的97%,一、微生物細(xì)胞的化學(xué)組成,1.化學(xué)元素,化學(xué)元素比例因菌種、培養(yǎng)條件等有所

3、不同，如： 幼齡菌含N高，硫細(xì)菌較多S，鐵細(xì)菌較多Fe等。,表微生物細(xì)胞中幾種主要元素的含量（干重的百分?jǐn)?shù)）,2.化學(xué)成分及其分析 化學(xué)元素組成有機(jī)物、無機(jī)物和水（7090） (1)有機(jī)物分析: 1）化學(xué)法直接抽提，定性定量分析 2）破碎細(xì)胞得亞顯微結(jié)構(gòu)，再分析 (2)無機(jī)物 (指與有機(jī)物相結(jié)合或單獨(dú)存在的無機(jī)鹽等物質(zhì),) 分析： 干細(xì)胞高溫爐（550）焚燒得到的灰分（ashcos tituent）無機(jī)方法分析其中各種無機(jī)元素含量。 (3)水分： 細(xì)胞表面水分吸干后的重量為濕重； 采用低溫真空干燥、紅外快速烘干方法烘干至恒重為干重。,碳源、 氮源、 能源、 生長因子、 無機(jī)鹽、 水,營養(yǎng)物質(zhì)按

4、照它們在機(jī)體中的生理作用不同，可以將它們區(qū)分成六大類。,二、微生物的營養(yǎng)物質(zhì)與功能,（一）碳源（Carbon source）,定義：一切能滿足微生物生長繁殖所需碳元素的營養(yǎng)物質(zhì)稱為碳源。,功能：提供合成細(xì)胞物質(zhì)及代謝物的原料;并為整個(gè)生理活動(dòng)提供所需要能源（異養(yǎng)微生物）。 種類: 無機(jī)含碳化合物：如CO2和碳酸鹽等。 有機(jī)含碳化合物：糖與糖的衍生物（多糖：如淀粉、 麩皮、米糠等；飴糖；單糖）,脂類、 醇類。有機(jī)酸、烴類、芳香族化合物 以及各種含氮的化合物。,表微生物的碳源譜,提供碳素的物質(zhì)，一般還是能源物質(zhì)。 微生物對碳源選擇性： 糖類一般是良好碳源和能源，對不同糖利用不同。 E.Coli在G

5、和半乳糖培養(yǎng)基生長，G為速效碳源， 后者為遲效碳源。 工業(yè)發(fā)酵一般用糖蜜、淀粉、飴糖等，為節(jié)約采用纖維素這種廣泛存在的物質(zhì)培養(yǎng)微生物。 不同菌種利用碳源能力不同，如：假單孢菌屬中的一些能利用90多種碳源；甲基營養(yǎng)型只利用甲醇、甲烷等一碳化合物為能源物質(zhì)。,微生物工業(yè)發(fā)酵中用做碳源的原料,傳統(tǒng)種類：糖,飴糖 淀粉（玉米粉、山芋粉、野生植物淀粉等） 麩皮 各種米糠等 代糧發(fā)酵：纖維素、石油、CO2、H2,種類：無機(jī)氮：銨鹽、硝酸鹽、亞硝酸鹽、氨、N2等 有機(jī)氮：蛋白質(zhì)及其降解產(chǎn)物（如胨、肽、 氨基酸等）、牛肉膏、魚粉、花生餅粉、 黃豆餅粉、玉米漿等,定義:凡用來構(gòu)成菌體物質(zhì)或代謝產(chǎn)物中氮素來源的營

6、養(yǎng)源。 功能： 1）提供合成細(xì)胞中含氮物，如蛋白質(zhì)、核酸以及含氮代謝物等的原料； 2）少數(shù)細(xì)菌可以銨鹽、硝酸鹽等氮源為能源。,（二）氮源（Nitrogen source ）：,表 2 微生物的氮源譜,實(shí)驗(yàn)室常用的氮源有碳酸銨、硝酸鹽、硫酸銨、尿素、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等。生產(chǎn)上常用的氮源有硝酸鹽、銨鹽、尿素、氨以及蛋白含量較高的魚粉、蠶蛹粉、黃豆餅粉、花生餅份、玉米漿等。 蛋白氮必須通過水解之后降解成胨、肽、氨基酸等才能被機(jī)體利用，這種氮源叫遲效氮源。 無機(jī)氮源或以蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物形式存在的有機(jī)氮源可以直接被菌體吸收利用，這種氮源叫做速效氮源。 速效氮源，通常有利于機(jī)體的生長，遲效氮源有利于代

7、謝產(chǎn)物的形成。,硝酸鹽NO3 NH4+,銨 鹽 氨基酸入胞 細(xì)胞物質(zhì) 蛋白胨,誘導(dǎo)酶,生理酸式鹽和生理堿式鹽,能源：能為微生物的生命活動(dòng)提供最初能量來源營養(yǎng)物或輻射能,能源譜,化學(xué)物質(zhì),輻射能,化能異養(yǎng)微生物的能源,有機(jī)物,無機(jī)物,化能自養(yǎng)微生物的能源,光能自養(yǎng)和光能異養(yǎng)微生物的能源,（三）能源,（四）生長因子（growth factor）：,定義:是一類對微生物正常生活所不可缺少而需要量又不大，但微生物自身不能用簡單的碳源或氮源合成，或合成量不足以滿足機(jī)體生長需要的有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)。不同微生物需求的生長因子的種類和數(shù)量不同。,微 生 物 生長因子 需要量（ml-1 III型肺炎鏈球菌（Strep

8、tococcus pneumoniae）膽堿 6ug 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）硫胺素 0.5ng 白喉棒桿菌（Cornebacterium diphtherriae）B-丙氨酸 1.5ug 破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌（Clostridium tetani）尿嘧啶 0-4ug 腸膜狀串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）吡哆醛 0.025ug,種類: 根據(jù)生長因子的化學(xué)結(jié)構(gòu)和它們在機(jī)體中的生理功能的不同，可將生長因子分為:,維生素、堿基、卟啉及其衍生物、甾醇、胺類、C4C6的分支或直鏈脂肪酸、氨基酸,缺乏合成生長因子能力的微生物稱為“營養(yǎng)缺陷型”

9、微生物。,最早發(fā)現(xiàn)的生長因子是維生素，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多維生素都能起生長因子的作用。維生素大部分是構(gòu)成酶的輔基或輔酶，需要量很少，但是缺少維生素微生物不能正常生長。 有些微生物缺乏或喪失合成某種或某些氨基酸的酶，所以不能合成生長所必需的氨基酸，這類微生物被稱為“氨基酸缺陷型”。 例如：腸膜明串珠菌（leuconostoc mesenteroides）常常需要由外源供給多種氨基酸才能生長。 另外有些微生物生長還需要其它特殊的成分，例如某些乳酸桿菌生長需要核苷；某些酵母菌和真菌生長需要肌醇；某些肺炎球菌生長需要膽堿等。,根據(jù)微生物對生長因子的需要存在差異，可分為：,1. 野生型(wild type)

10、 原養(yǎng)型 不需要生長因子而能在基礎(chǔ)培養(yǎng)基 上生長的菌株 2. 營養(yǎng)缺陷型(auxotroph) 由于自發(fā)或誘發(fā)突變等原因從野生 型菌株產(chǎn)生的需要提供特定生長素物質(zhì)才能生長的菌株,（五）無機(jī)鹽（inorganic salt）,定義：為微生物細(xì)胞生長提供碳、氮源以外的多種重要元素（包括大量元素和微量元素）的物質(zhì)，多以無機(jī)鹽的形式供給。 大量元素：P、S、K、Mg、Ca、Na、Fe （微生物生長所需濃度在10-310-4mol/L） 微量元素：Cu、Zn、Mn、Mo、Co （微生物生長所需濃度在10-610-8mol/L）,根據(jù)微生物對礦質(zhì)元素需要量大小可以把它分成：,無機(jī)鹽的生理功能：,無機(jī)元素的

11、來源和功能,水是微生物生長所必不可少的。水在細(xì)胞中的生理功能主要有：,起到溶劑與運(yùn)輸介質(zhì)的作用；,參與細(xì)胞內(nèi)一系列化學(xué)反應(yīng)；,維持蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子穩(wěn)定的天然構(gòu)象；,通過水合作用與脫水作用控制由多亞基組成的結(jié)構(gòu),熱的良好導(dǎo)體；,（六） 水,水在細(xì)胞中有兩種存在形式： 結(jié)合水和游離水. 不同細(xì)胞及不同細(xì)胞結(jié)構(gòu)中游離水的含量有較大差別：,微生物對水的需要程度（水對微生物生長的影響）常用環(huán)境（或基質(zhì)）中的水活度值（water activity, w）表示。所謂w就是水的有效濃度。 定義：水活度為在一定的溫度條件下，溶液的蒸汽壓與相同條件下純水的蒸汽壓之比， 即：w=/ o 表示溶液的蒸汽壓 o

12、表示純水的蒸汽壓 在w為0.600.99的環(huán)境條件均有微生物生長，但對某種微生物而言，它對w的要求是一定的。即微生物不同，其生長的最適w亦不同。,表幾類微生物生長最適w,三、微生物的營養(yǎng)類型,根據(jù)生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)的性質(zhì)（碳源），可將生物分成兩種基本的營養(yǎng)類型 異養(yǎng)型生物：在生長時(shí)需要以復(fù)雜的有機(jī)物質(zhì)作為營養(yǎng)物質(zhì) 自養(yǎng)型生物：在生長時(shí)能以簡單的無機(jī)物質(zhì)作為營養(yǎng)物質(zhì) 動(dòng)物屬于異養(yǎng)型生物，植物屬于自養(yǎng)型，而微生物既有異養(yǎng)型的也有自養(yǎng)型的，大多數(shù)微生物屬于異養(yǎng)型生物，少數(shù)微生物屬于自養(yǎng)型生物。 根據(jù)生長時(shí)能量的來源不同，又可將生物分成兩種類型 化能營養(yǎng)型生物：依靠化合物氧化釋放的能量進(jìn)行生長 光能

13、營養(yǎng)型生物：依靠光能進(jìn)行生長 動(dòng)物和大部分微生物屬于化能營養(yǎng)型生物，它們從物質(zhì)的氧化過程中獲得能量。植物和少部分微生物屬于光能營養(yǎng)型生物 按供氫體分,無機(jī)營養(yǎng)型生物； 有機(jī)營養(yǎng)型生物：,異養(yǎng)型生物,自養(yǎng)型生物,根據(jù)生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)的性質(zhì)（碳源）,根據(jù)生物生長過程中能量的來源,光能營養(yǎng)型,化能營養(yǎng)型,根據(jù)碳源、能源及電子供體性質(zhì)的不同，可將微生物分為：,光能無機(jī)自養(yǎng)型(photolithoautotrphy),光能有機(jī)異養(yǎng)型(photoorganoheterotrphy),化能無機(jī)自養(yǎng)型(chemolithoautotrphy),化能有機(jī)異養(yǎng)型(chemoorganoheterotrophy

14、),微生物的營養(yǎng)類型：,能以CO2為唯一或主要碳源；,進(jìn)行光合作用獲取生長所需要的能量；,以無機(jī)物如H2O、H2S、S等作為供氫體或電子供體，使CO2還原為細(xì)胞物質(zhì)；,例如，藻類及藍(lán)細(xì)菌等和植物一樣，以水為電子供體（供氫體）， 進(jìn)行產(chǎn)氧型的光合作用，合成細(xì)胞物質(zhì)。而紅硫細(xì)菌，以H2S為 電子供體，產(chǎn)生細(xì)胞物質(zhì)，并伴隨硫元素的產(chǎn)生。,CO2+ 2H2S,光能,光合色素, CH2O + 2S+ H2O,（一）光能無機(jī)自養(yǎng)型（光能自養(yǎng)型）,不能以CO2為主要或唯一的碳源；,以有機(jī)物作為供氫體，利用光能將CO2還原為細(xì)胞物質(zhì)；,在生長時(shí)大多數(shù)需要外源的生長因子；,例如，紅螺菌屬中的一些細(xì)菌能利用異丙醇

15、作為供氫體，將CO2還原成細(xì)胞物質(zhì)，同時(shí)積累丙酮。,CO2,2(H3C)2 CHOH,光能,光合色素,2 CH3C0CH3 + CH2O + H2O,（二）光能有機(jī)異養(yǎng)型（光能異養(yǎng)型）,+,生長所需要的能量來自無機(jī)物氧化過程中放出的化學(xué)能；,以CO2或碳酸鹽作為唯一或主要碳源進(jìn)行生長時(shí)，利用 H2、H2S、Fe2+、NH3或NO2-等作為電子供體使CO2還原 成細(xì)胞物質(zhì)。,化能無機(jī)自養(yǎng)型只存在于微生物中，可在完全無機(jī)及無光的環(huán)境中生長。它們廣泛分布于土壤及水環(huán)境中,參與地球物質(zhì)循環(huán).,（三）化能無機(jī)自養(yǎng)型（化能自養(yǎng)型）,亞硝化細(xì)菌 2NH4+ +3O22NO2- +2H2O + 4H+132K

16、cal 硝化細(xì)菌 NO2- +1/2O2 NO3- +18.1 Kcal,1. 硝化細(xì)菌:,通過氧化還原態(tài)的無機(jī)硫化物（H2S、S、 S2O32- 、SO32-）獲得能量（硫桿菌屬，硫微螺菌屬） H2S + 1/2 O2 S +H2O + 50.1 Kcal S + 1 1/2 O2+H2O H2SO4+149.8 Kcal,2. 硫化細(xì)菌:,氧化Fe2+為Fe3+獲取能量并同化 CO2 2Fe2+1/2O2+2H+ 2Fe3+H2O+21.2 Kcal 4. 氫細(xì)菌：具有氫化酶，從氫的氧化獲取能 量，同化CO2 H2+ 1/2 O2 H2O + 56.7 Kcal,3. 鐵細(xì)菌：,生長所需要

17、的能量均來自有機(jī)物氧化過程中放出的化學(xué)能；,生長所需要的碳源主要是一些有機(jī)化合物，如淀粉、糖類、纖維素、有機(jī)酸等。,有機(jī)物通常既是碳源也是能源；,大多數(shù)細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物都是化能有機(jī)異養(yǎng)型微生物；,所有致病微生物均為化能有機(jī)異養(yǎng)型微生物；,（四）化能有機(jī)異養(yǎng)型（化能異養(yǎng)型）,不同營養(yǎng)類型之間的界限并非絕對,異養(yǎng)型微生物并非絕對不能利用CO2；,自養(yǎng)型微生物也并非不能利用有機(jī)物進(jìn)行生長；,有些微生物在不同生長條件下生長時(shí),其營養(yǎng)類型也會(huì)發(fā)生改變；,例如紫色非硫細(xì)菌(purple nonsulphur bacteria)： 沒有有機(jī)物時(shí)，同化CO2， 為自養(yǎng)型微生物； 有機(jī)物存在時(shí)，利用有機(jī)物進(jìn)

18、行生長，為異養(yǎng)型微生物； 光照和厭氧條件下，利用光能生長，為光能營養(yǎng)型微生物； 黑暗與好氧條件下，依靠有機(jī)物氧化產(chǎn)生的化學(xué)能生長，為化能營養(yǎng)型微生物,微生物營養(yǎng)類型的可變性無疑有利于提高其對環(huán)境條件變化的適應(yīng)能力,第二節(jié) 培養(yǎng)基(medium),定義：應(yīng)科研或生產(chǎn)的需要，由人工配制的、適合于不同微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物用的營養(yǎng)基質(zhì)（混合養(yǎng)料）。 特點(diǎn)：任何培養(yǎng)基都應(yīng)具備微生物所需要的六大營養(yǎng)要素，且應(yīng)比例適當(dāng)。所以一旦配成必須立即滅菌。,用途：促使微生物生長；積累代謝產(chǎn)物；分離微生物菌種；鑒定微生物種類；微生物細(xì)胞計(jì)數(shù)；菌種保藏；制備微生物制品,一、培養(yǎng)基的配制原則,（一）培養(yǎng)基組分應(yīng)適合

19、微生物的營養(yǎng)特點(diǎn)（目的明確） （二）營養(yǎng)物的濃度與比例應(yīng)恰當(dāng)（營養(yǎng)協(xié)調(diào)） （三）物理化學(xué)條件適宜（理化條件適宜） （四）根據(jù)培養(yǎng)目的選擇原料及其來源（經(jīng)濟(jì)節(jié)約）,（一）目的明確,即根據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基。 不同營養(yǎng)類型的微生物，其對營養(yǎng)物的需求差異很大。如自養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基完全可以（或應(yīng)該）由簡單的無機(jī)物質(zhì)組成。異養(yǎng)做生物的培養(yǎng)基至少需要含有一種有機(jī)物質(zhì)，但有機(jī)物的種類需適應(yīng)所培養(yǎng)菌的特點(diǎn)。 按微生物的主要類群來說，它們所需要的培養(yǎng)基成分也不同： 細(xì)菌： 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 LB (Luria-Bertani) 放線菌： 高氏一號培養(yǎng)基 真菌： 查氏合成培養(yǎng)基 PDA (P

20、otato-Dextrose-Agar) 酵母菌； 麥芽汁 當(dāng)對試驗(yàn)菌營養(yǎng)需求特點(diǎn)不清楚的時(shí)候，可以采用生長譜法進(jìn)行測定。,培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)濃度合適時(shí)微生物才能生長良好，營養(yǎng)物質(zhì)濃度過低時(shí)不能滿足微生物正常生長所需，濃度過高時(shí)則可能對微生物生長起抑制作用。,培養(yǎng)基中各營養(yǎng)物質(zhì)之間的濃度配比也直接影響微生物的生長繁殖和代謝產(chǎn)物的形成和積累，其中碳氮比（C/N）的影響較大。碳氮比指培養(yǎng)基中碳元素與氮元素的物質(zhì)的量比值，有時(shí)也指培養(yǎng)基中還原糖與粗蛋白之比。,（二）營養(yǎng)協(xié)調(diào),濃度過高微生物的生長起抑制作用， 濃度過小不能滿足微生物生長的需要。,C/N比值=,碳源中的碳原子的mol數(shù) 氮源中所含的氮原子

21、的mol數(shù),速效性氮（或碳）源與遲效性氮（或碳）源的比例 各種金屬離子間的比例,例：在利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸的過程中，培養(yǎng)基 C/N 4/1時(shí)，菌體大量繁殖，谷氨酸積累少；當(dāng)培養(yǎng)基 C/N3/1 時(shí)，菌體生長受抑制，而谷氨酸大量增加。,碳氮比（C/N）直接影響微生物生長與繁殖及代謝物的形成與積累，故常作為考察培養(yǎng)基組成時(shí)的一個(gè)重要指標(biāo)；,pH,水活度,氧化還原電位,（三）理化條件適宜,滲透壓,與,培養(yǎng)基的pH必須控制在一定的范圍內(nèi)，以滿足不同類型 微生物的生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。,通常培養(yǎng)條件： 細(xì)菌與放線菌：pH77.5 酵母菌和霉菌：pH4.56范圍內(nèi)生長,在微生物的生長和代謝過程中，由

22、于營養(yǎng)物質(zhì)的利用和代謝產(chǎn)物的形成與積累，培養(yǎng)基的初始pH值會(huì)發(fā)生改變，為了維持培養(yǎng)基pH值的相對恒定，通常采用下列兩種方式： 內(nèi)源調(diào)節(jié)：在培養(yǎng)基里加一些緩沖劑或不溶性的碳酸鹽；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的碳氮比。 外源調(diào)節(jié)：按實(shí)際需要不斷向發(fā)酵液流加酸或堿液,1. pH,2. 滲透壓和水活度aw,滲透壓 等滲溶液適宜微生物生長 高滲溶液細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離 低滲溶液細(xì)胞吸水膨脹，直至破裂,大多數(shù)微生物適合在等滲的環(huán)境下生長，而有的菌如Staphylococcus aureus則能在3mol/L NaCl的高滲溶液中生長。能在高鹽環(huán)境（2.86.2/L NaCl）生長的微生物常被稱為嗜鹽微生物（Halophiles

23、）。,在天然環(huán)境中，微生物可實(shí)際利用的自由水或游離水的含量， 一般用在一定的溫度和壓力條件下,溶液的蒸汽壓力與同樣條件下純水蒸汽壓力之比表示，即： w=Pw/Pow 式中Pw代表溶液蒸汽壓力, POw代表純水蒸汽壓力。 純水w為1.00,溶液中溶質(zhì)越多, w越小。,微生物一般在w為0.600.99的條件下生長, w過低時(shí), 微生物生長的遲緩期延長,比生長速率和總生長量減少。 微生物不同，其生長的最適w不同。,水活度w,氧化還原電位又稱氧化還原電勢（redox potential），是度量某氧化還原系統(tǒng)中的還原劑釋放電子或氧化劑接受電子趨勢的一種指標(biāo)，其單位是V（伏）或mV（毫伏）。,不同類型微

24、生物生長對氧化還原電位的要求不同,好氧性微生物：+0.1伏以上時(shí)可正常生長,以+0.3+0.4伏為宜； 厭氧性微生物：低于+0.1伏條件下生長； 兼性厭氧微生物：+0.1伏以上時(shí)進(jìn)行好氧呼吸, +0.1伏以下時(shí)進(jìn)行發(fā)酵。,3. 氧化還原電位,以粗代精,以野代家,以廢代好,以國代進(jìn),以簡代繁,以氮代朊,以烴代糧,以纖代糖,（四） 經(jīng)濟(jì)節(jié)約,1.生態(tài)模擬 調(diào)查所培養(yǎng)菌的生態(tài)條件，查看“嗜好”，對“癥”下料初級天然培養(yǎng)基. 2.查閱文獻(xiàn) 查閱、分析文獻(xiàn)，調(diào)查前人的工作資料，借鑒人家的經(jīng)驗(yàn)，以便從中得到啟發(fā)設(shè)計(jì)有自己特色的培養(yǎng)基配方. 3.精心設(shè)計(jì) 借助優(yōu)選法或正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法等方法.,二、設(shè)計(jì)培養(yǎng)基的

25、方法,二、設(shè)計(jì)培養(yǎng)基的方法（續(xù)）,4、實(shí)驗(yàn)比 較： 不同培養(yǎng)基配方的選擇比較 單種成分來源和數(shù)量的比較 幾種成分濃度比例調(diào)配的比較 小型試驗(yàn)放大到大型生產(chǎn)條件的比較 pH和溫度試驗(yàn),附1：配置培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問題及解決方法：,1、沉淀 2、膠體強(qiáng)度的破壞 3、褐色物質(zhì)的形成 4、pH發(fā)生變化,高壓蒸氣滅菌 一般培養(yǎng)基: 1.05 Kg/cm2, 121.3, 15-30 min 含糖培養(yǎng)基: 0.56 Kg/cm2, 112.6 , 20-30 min 過濾滅菌, 分別滅菌, 間歇滅菌的應(yīng)用,附2：培養(yǎng)基的滅菌,附圖：過濾滅菌,附3：器皿的滅菌及無菌室的消毒,器皿的滅菌： 干熱空氣： 16

26、0， 2 小時(shí) 無菌室的消毒： 紫外光 化學(xué)藥物熏蒸（苯酚；高錳酸鉀+甲醛）,三、培養(yǎng)基的類型及其應(yīng)用,-1根據(jù)所培養(yǎng)微生物的微生物類群來分 細(xì)菌培養(yǎng)基 放線菌培養(yǎng)基 霉菌培養(yǎng)基 -2 根據(jù)培養(yǎng)目的來分 種子培養(yǎng)基(seed culture medium)是為保證發(fā)酵生產(chǎn)獲得大量優(yōu)質(zhì)種子而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，特點(diǎn)是營養(yǎng)較豐富，氮源比例較高。有時(shí)為使菌種能迅速適應(yīng)后面的發(fā)酵條件，還有意識地加入發(fā)酵培養(yǎng)基的基質(zhì)。 發(fā)酵培養(yǎng)基(fermentation medium)用于生產(chǎn)預(yù)定發(fā)酵產(chǎn)物，一般以碳為主要元素，碳源含量往往高于種子培養(yǎng)基。大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，原料應(yīng)價(jià)廉易得，還應(yīng)有利于下游的分離提取。,-1,細(xì)菌培

27、養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯（nutrient broth)： 牛肉膏 3g； 水 1000ml； 蛋白胨 5g ； pH 7.27.4 放線菌培養(yǎng)基高氏1號： 可溶性淀粉 20g； KNO3 1g; K2HPO4 1g MgSO4 0.5g NaCl 1g; FeSO47H2O 0.5g 水 1000ml; pH 7.27.4 霉菌培養(yǎng)基查氏（zapek)培養(yǎng)基： 蔗糖 30g; KCl 0.5g; MgSO4.H2O 0.5g; FeSO4 0.5g 水 1000ml; K2HPO4 1g; NaNO3 3g; pH 6.7 酵母菌培養(yǎng)基麥芽汁培養(yǎng)基,味精生產(chǎn)菌北京棒狀桿菌AS1299的一級種子（用搖床培

28、養(yǎng)） 培養(yǎng)基配方：,葡萄糖 3% 玉米漿 2.53.5% 尿素 0.30.5% K2HPO4 0.10.2% MgSO4 0.05%,二級種子（1200升發(fā)酵罐）培養(yǎng)基配方：以水解糖3%代替葡萄糖3%，其他成分相同。,-2,天然培養(yǎng)基(complex medium)：也稱作chemically undefined medium。利用化學(xué)成分還不完全清楚或不恒定的天然物質(zhì)，（如肉湯、蛋白胨、麥芽汁、酵母汁、豆芽汁、玉米粉、牛奶、血清等）制成的培養(yǎng)基，天然培養(yǎng)基比較經(jīng)濟(jì)，除實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常使用外，也適于用來進(jìn)行工業(yè)上大規(guī)模的微生物發(fā)酵生產(chǎn)。 合成（組合）培養(yǎng)基(synthetic medium)：也稱作

29、chemically defined medium. 由化學(xué)成分完全了解的物質(zhì)配制而成的培養(yǎng)基，該類培養(yǎng)基的組成成分精確、清楚，重復(fù)性強(qiáng)，但微生物生長較慢，且價(jià)格昂貴，故一般適于在實(shí)驗(yàn)室用來進(jìn)行有關(guān)微生物營養(yǎng)需要、代謝、分類鑒定、生物測定以及菌種選育、遺傳分析等方面的研究工作。如高氏培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基等. 半組合培養(yǎng)基(semi-defined medium)：在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加些天然成份，以更有效地滿足微生物對營養(yǎng)物的需要.如馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基,-3 按對培養(yǎng)基成分的了解程度來分,按成分不同劃分,天然培養(yǎng)基,合成培養(yǎng)基,含用化學(xué)成分還不清楚或化學(xué)成分不恒定的天然有機(jī)物,牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

30、、麥芽汁培養(yǎng)基,化學(xué)成分完全了解的物質(zhì)配制而成的培養(yǎng)基,高氏1號培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基,半合成培養(yǎng)基,主要以化學(xué)試劑配制同時(shí)還加有天然成分的培養(yǎng)基,馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基,現(xiàn)有一培養(yǎng)基配方如下: 可溶性淀粉5g、 蛋白胨1.5g、 磷酸二氫鉀0.5g、硫酸鎂0.1 g、瓊脂2.0 g，水100ml， pH5.0，試回答下列問題: (l)按營養(yǎng)物質(zhì)來源分類, 屬何種類型培養(yǎng)基?為什么? (2)此培養(yǎng)基適于培養(yǎng)哪類微生物?為什么? (3)簡述配制200ml該斜面培養(yǎng)基的操作過程。,思考題:,有一種子培養(yǎng)基配方如下葡萄糖2.0g、尿素0.5g、玉米漿1.0g、K2HPO4 0.1g、 MgSO4 0.05g、

31、水100ml，pH 6.8， 試回答下列問題 (1)該培養(yǎng)基適宜于培養(yǎng)哪一類型的微生物？為什么？ (2)按培養(yǎng)基中營養(yǎng)物的來源分類，屬于哪一類培養(yǎng)基？為什么？ (3)該培養(yǎng)基中各組分分別起什么作用？ (4)若要配制此種斜面培養(yǎng)基200mL，應(yīng)如何操作？ 答： (1) 此培養(yǎng)基適于培養(yǎng)細(xì)菌。 因pH 6.8適于培養(yǎng)細(xì)菌和放線菌, 但放線菌能直接利用可溶性淀粉為碳源, 不必采用葡萄糖。 (2) 屬半合成培養(yǎng)基。 因培養(yǎng)基中，一部分采用天然材料，另一部分用已知的化學(xué)藥品組成。,答： (1) 此培養(yǎng)基適于培養(yǎng)細(xì)菌。 因pH 6.8適于培養(yǎng)細(xì)菌和放線菌, 但放線菌能直接利用可溶性淀粉為碳源, 不必采用葡

32、萄糖。 (2) 屬半合成培養(yǎng)基。 因培養(yǎng)基中，一部分采用天然材料，另一部分用已知的化學(xué)藥品組成。 (3)該培養(yǎng)基中葡萄糖為碳源, 尿素為氮源, 玉米漿為生長因子、 K2HPO4 和MgSO4為無機(jī)鹽類。 (4) 操作過程：準(zhǔn)確稱量葡萄糖4g、尿素1g、玉米漿2g、磷酸氫二鉀0.2g于500ml燒杯中 加入約190ml水溶解 調(diào)節(jié)pH 6.8 加硫酸鎂0.1g 定容至200ml 校正pH值 分裝三角瓶 包扎滅菌 。, 固體培養(yǎng)基(solid medium)：天然固體營養(yǎng)基質(zhì)制成的培養(yǎng)基，或液體培養(yǎng)基中加入一定量凝固劑（瓊脂1.52)而呈固體狀態(tài)的培養(yǎng)基。為微生物的生長提供營養(yǎng)表面。常用于微生物的

33、分離、純化、計(jì)數(shù)等方面的研究?？梢罁?jù)使用目的不同而制成斜面、平板等形式. 半固體培養(yǎng)基(semi-solid medium)：在液體培養(yǎng)基中加入0.2-0.7的瓊脂構(gòu)成的培養(yǎng)基。常用來觀察細(xì)菌運(yùn)動(dòng)的特征，以進(jìn)行菌種鑒定和噬菌體效價(jià)滴定等方面的實(shí)驗(yàn)工作。 液體培養(yǎng)基(liquid medium)：液體培養(yǎng)基不含任何凝固劑，菌體與培養(yǎng)基充分接觸，操作方便，常用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)以及在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物生理代謝等基本理論的研究工作。可依據(jù)培養(yǎng)后的濁度判斷微生物的生長程度.,-4按制備后培養(yǎng)基外觀的物理狀態(tài)來分,按物理狀態(tài)不同劃分,固體培養(yǎng)基,液體培養(yǎng)基,在液體培養(yǎng)基中加入一定量凝固劑，使其成為固體狀態(tài)

34、，瓊脂含量一般為1.5%-2.0%,瓊脂含量一般為0.2%-0.7%,不加任何凝固劑,半固體培養(yǎng)基,固體培養(yǎng)基常用來進(jìn)行微生物的分離、鑒定、活菌計(jì)數(shù)及菌種保藏,觀察微生物的運(yùn)動(dòng)特征、分類鑒定及噬菌體效價(jià)滴定,大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)及在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用方面的研究,1.不被微生物分解、利用、液化； 2.不因消毒滅菌而被破壞； 3.在微生物的生長溫度內(nèi)保持固態(tài)； 4.凝固點(diǎn)的溫度對微生物無害； 5.透明度好，粘著力強(qiáng),理想凝固劑應(yīng)具備的條件, 選擇性培養(yǎng)基(selective medium)：是根據(jù)某種或某一類群微生物的特殊營養(yǎng)需要，或?qū)δ撤N化合物的敏感性不同而設(shè)計(jì)出來的一類培養(yǎng)基。利用這種

35、培養(yǎng)基可用來將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來. 加富培養(yǎng)基(enriched medium)：在普通培養(yǎng)基中加入某些特殊的營養(yǎng)物，如血、血清、動(dòng)、植物組織液或其他營養(yǎng)物質(zhì)（或生長因子）的一類營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基。用來培養(yǎng)營養(yǎng)要求苛刻的微生物，或用以富集（數(shù)量上占優(yōu)勢）和分離某種微生物. 鑒別性培養(yǎng)基(differential medium)：用于鑒別不同類型微生物的培養(yǎng)基，在普通培養(yǎng)基中加入能與某種代謝產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)的指示劑或化學(xué)藥品，從而產(chǎn)生某種明顯的特征性變化，以區(qū)別不同的微生物，例：伊紅美蘭乳糖培養(yǎng)基（Eosin Methylene Blue）,-5 按特殊用途劃分,按用途不同劃

36、分,鑒別培養(yǎng)基,用來將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來的培養(yǎng)基,用于鑒別不同類型微生物的培養(yǎng)基,選擇培養(yǎng)基,在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某些特殊營養(yǎng)物質(zhì)制成的一類營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基,微生物產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物，與培養(yǎng)基中的特殊化學(xué)物質(zhì)發(fā)生特定的化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的特征變化,加富培養(yǎng)基,特殊營養(yǎng)物質(zhì)包括血液、血清、酵母浸膏、動(dòng)植物組織液等,在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的特殊營養(yǎng)物質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)，抑制不需要的微生物的生長，有利于所需微生物的生長,伊紅美蘭乳糖培養(yǎng)基(Eosin Methylene blue),G+菌受抑制,G-菌,能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸,不發(fā)酵乳糖不產(chǎn)酸，菌落無色透明,產(chǎn)酸力強(qiáng)，菌落呈紫綠色金屬光澤,產(chǎn)酸

37、力弱，菌落棕色,Enterbacter Klebsiella Hafnia Sarrdia,Proteus Salmonella Shigella,E.coli,試樣,EMB在鑒別各種腸道桿菌中的作用：,常用的一些鑒別培養(yǎng)基,思考題：,答： （1）從苯含量較高的環(huán)境中采集土樣或水樣； （2）配制培養(yǎng)基，制備平板，一種僅以苯作為唯一碳源（A），另一種不含任何碳源作為對照（B）； （3）將樣品進(jìn)行梯度稀釋，涂布A平板； （4）將平板置于適當(dāng)溫度條件下培養(yǎng)，觀察是否有菌落產(chǎn)生；,如果要從環(huán)境中分離得到能利用苯作為碳源和能源的微生物純培養(yǎng)物，你該如何設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)？,（5）將A平板上的菌落編號并分別轉(zhuǎn)接至B

38、平板，置于相同溫度條件下培養(yǎng)（在B平板上生長的菌落，是可利用空氣中CO2的自養(yǎng)型微生物）； （6）挑取在A平板上生長而不在B平板上生長的菌落，在一個(gè)新的A平板上劃線、培養(yǎng)，獲得單菌落，初步確定為可利用苯作為碳源和能源的微生物純培養(yǎng)物； （7）將初步確定的目標(biāo)菌株轉(zhuǎn)接至以苯作為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，利用相應(yīng)化學(xué)分析方法定量分析該菌株分解利用苯的情況。,答：不能。 因?yàn)椋?）不同微生物的營養(yǎng)需求、最適生長溫度等生長條件有差別，在同一平板上相同條件下的生長及生理狀況不同； （2）不同微生物所產(chǎn)蛋白酶的性質(zhì)（如最適催化反應(yīng)溫度、pH、對底物酪素的降解能力等）不同；,某學(xué)生利用酪素培

39、養(yǎng)基平板篩選產(chǎn)胞外蛋白酶細(xì)菌，在酪素培養(yǎng)基平板上發(fā)現(xiàn)有幾株菌的菌落周圍有蛋白水解圈，是否能僅憑蛋白水解圈與菌落直徑比大，就斷定該菌株產(chǎn)胞外蛋白酶的能力就大，而將其選擇為高產(chǎn)蛋白酶的菌種，為什么？,（3）該學(xué)生所采用的是一種定性及初步定量的方法，應(yīng)進(jìn)一步針對獲得的幾株菌分別進(jìn)行培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化，并在分析這些菌株所產(chǎn)蛋白酶性質(zhì)的基礎(chǔ)上利用搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)確定蛋白酶高產(chǎn)菌株。,現(xiàn)擬從自然界中分離篩選出產(chǎn)蛋白酶的芽孢桿菌，請結(jié)合所學(xué)知識設(shè)計(jì)分離篩選的試驗(yàn)方案。,答題要點(diǎn)： （1） 應(yīng)該到富含蛋白質(zhì)的地方采集含分離樣品。 （2） 根據(jù)該菌的耐熱特性可采用將含菌樣品加熱80處理10min后，殺死不耐熱雜菌, 濃縮芽孢桿菌。 （3） 可采用劃線分離、稀釋分離、刮棒連續(xù)涂布等純培養(yǎng)物分離方法。 （4）初步判斷所獲得純培養(yǎng)物為芽孢桿菌。 （5）可采用酪素鑒別培養(yǎng)基根據(jù)水解圈篩選產(chǎn)蛋白酶