1、江南大學,1,代謝組學-方法與應用 授課教師 ：吳敬 教授 授課時間：2009年11月,江南大學,2,“基因組學反映了什么是可以發(fā)生的，轉錄組學反映的是將要發(fā)生的，蛋白質組學指出了賴以發(fā)生的，只有代謝組學才真正反映業(yè)已發(fā)生的?！?許國旺,江南大學,3,第一章 代謝組學的簡介 第二章 代謝組學的研究方法 第四章 代謝組學的應用 第五章 代謝組學的發(fā)展前景,江南大學,4,組學時代4種最重要的組學,江南大學,5,代謝組學（Metabonomics/ Metabolomics ）是通過考察生物體系（細胞、組織 或生物體）受刺激或擾動后（如將某個特定的基因變異或環(huán)境變化后），其代謝產物的變化或其隨時間的

2、變化，來研究生物體系的一門科學。 代謝組（metabolome）是基因組的下游產物也是最終產物，是一些參與生物體新陳代謝、維持生物體正常生長功能 和生長發(fā)育的小分子化合物的集合，主要是相對分子量小于1000的內源性小分子。 代謝物數(shù)量因物種不同而差異較大： 植物（200 000種）、動物（2500種）、微生物（1500種）,江南大學,6,代謝組學是繼基因組學和蛋白質組學之后新近發(fā)展起來的一門學科，是系統(tǒng)生物學的重要組成部分。 基因組學和蛋白質組學分別從基因和蛋白質層面探尋生命的活動，而實際上細胞內許多生命活動是發(fā)生在代謝物層面的，如細胞信號釋放（cell signaling），能量傳遞，細胞間

3、通信等都是受代謝物調控的。代謝組學正是研究代謝組（metabolome）在某一時刻細胞內所有代謝物的集合的一門學科?；蚺c蛋白質的表達緊密相連，而代謝物則更多地反映了細胞所處的環(huán)境，這又與細胞的營養(yǎng)狀態(tài)，藥物和環(huán)境污染物的作用，以及其它外界因素的影響密切相關。 因此有人認為，“基因組學和蛋白質組學告訴你什么可能會發(fā)生，而代謝組學則告訴你什么確實發(fā)生了?！保˙ill Lasley, UC Davis）,江南大學,7,第一章 代謝組學簡介代謝組學的發(fā)展,江南大學,8,代謝組學的特點： 關注內源化合物 對生物體系的小分子化合物進行定量定性研究 上述化合物的上調和下調指示了與疾病、毒性、基因修飾或環(huán)境

4、因子的影響 上述內源性化合物的知識可以被用于疾病的診斷和藥物篩選 與轉錄組學和蛋白組學相比，代謝組學有以下優(yōu)點： 基因與蛋白質表達的微小變化會在代謝物上得到放大，從而使檢測更容易 代謝組學的研究不需要建立全基因測序及大量序列標簽（EST）的數(shù)據(jù)庫 代謝物的研究種類遠小于蛋白質的數(shù)目 研究中采用的技術更通用,江南大學,9,Genomics and Proteomics are not sufficient to describe reasons for toxicity or disease state 基因組學和蛋白組學對于毒性或疾病狀態(tài)的描述是不足的 Neither Genomics nor

5、 Proteomics can produce time course information which is important for animal to animal comparison 基因組學和蛋白組學都不能提供動態(tài)信息，但這些信息對于動物間的比較是重要的 Metabolite profiling produces information on the biochemical pathways effected 代謝物分析能提供生化途徑結果的信息 Monitoring metabolites allows concurrent or sequential affects to b

6、e monitored, e.g. blocking of a metabolic pathway in the liver can lead to toxicity in the brain (hydrazine) 代謝監(jiān)控可監(jiān)控即時或相繼的結果，例如：阻斷肝臟中代謝途徑會在腦中產生毒性肼 Metabonomics, unlike the other “omics” is non-invasive 不像別的組學研究，代謝組學是無創(chuàng)的,The Need for Metabonomic Information,江南大學,10,代謝組學研究現(xiàn)狀 代謝組學屬于全局系統(tǒng)生物學（Global syste

7、ms biology）研究方法，便于對復雜體系的整體進行認識譬如，一個正常工作的人體包括“人體”本身和與之共同進化而來且共生的消化道微生物群體（或稱菌群），孤立地研究“人體”本身的基因，轉錄子以及蛋白質當然可以為人們認識人體生物學提供重要信息，但無法提供使人體正常工作不可缺少的菌群的信息人體血液和尿液的代謝組卻攜帶著包括菌群在內的每一個細胞的信息，因此代謝組學方法對研究如人體這樣復雜的進化雜合體十分有效,江南大學,11,不同器官組織具有不同的代謝輪廓，廣譜全采集,江南大學,12,代謝組學已經(jīng)廣泛地應用到了包括藥物研發(fā),分子生理學,分子病理學,基因功能組學,營養(yǎng)學,環(huán)境科學等重要領域.在代謝組學

8、誕生后的6年里,有關代謝組學的研究論文和專利以指數(shù)的形式逐年增長.,江南大學,13,代謝組學與系統(tǒng)生物學 系統(tǒng)生物學概念的誕生標志著研究哲學由還原論向整體論的變化.系統(tǒng)生物學的中心任務就是要針對生物系統(tǒng)整體(無論它是生物細胞,多細胞組織,器官還是生物整體),建立定量,普適,整體和可預測(QUIP)的認知. 具體而言,系統(tǒng)生物學研究就是要將給定生物系統(tǒng)的基因,轉錄,蛋白質和代謝水平所發(fā)生的事件,相關性及其對所涉及生物過程的意義進行整體性認識，從而出現(xiàn)了許多的組和組學的新概念.,江南大學,14,現(xiàn)已提出的一百多個組和組學,可以大體歸納為基因組/基因組學,轉錄組/轉錄組學,蛋白質組/蛋白質組學和代謝

9、組/代謝組學四個方面.顯而易見,DNA,mRNA以及蛋白質的存在為生物過程的發(fā)生提供了物質基礎(但這個過程有可能不發(fā)生!),而代謝物質所反映的是已經(jīng)發(fā)生了的生物學事件.因此代謝組學是對一個生物系統(tǒng)進行全面認識的不可缺少的一部分,是全局系統(tǒng)生物學(global systems biology)的重要基礎,江南大學,15,第二章 微生物代謝組學的研究方法 Challenges of MetabonomicsSample Complexity and Data Handling,Each sample has., a wide range of compound classes a wide var

10、iation in metabolite concentrations a large number of potential components,Each group of samples has, many sample analyses are required for statistical relevance a complex raw dataset that needs to be processed differences between sample groups which need to be highlighted,江南大學,16,代謝組學(metabonomicsm

11、etabolomics)是效仿基因組學和蛋白質組學的研究思想，對生物體內所有代謝物進行定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化的相對關系的研究方式，是系統(tǒng)生物學的組成部分。 其研究對象大都是相對分子質量1000以內的小分子物質。先進分析檢測技術結合模式識別和專家系統(tǒng)等計算分析方法是代謝組學研究的基本方法。,江南大學,17,代謝組學利用高通量、高靈敏度與高精確度的現(xiàn)代分析技術，動態(tài)跟蹤細胞、有機體分泌出來的體液中的代謝物的整體組成，借助多變量統(tǒng)計方法，來辯識和解析被研究對象的生理、病理狀態(tài)及其與環(huán)境因子、基因組成等的關系。 “代謝組學”是一種整體性的研究策略，其研究策略有點類似于通過分析發(fā)動機的尾氣

12、成分，來研究發(fā)動機的運行規(guī)律和故障診斷等的“反向工程學”的技術思路。由于代謝組學著眼于把研究對象作為一個整體來觀察和分析，也被稱為“整體的系統(tǒng)生物學”。,江南大學,18,研究方法和步驟 樣品制備：足量的代表性樣品（-80保存） 2.數(shù)據(jù)采集和標志物識別：常用色譜-質譜聯(lián)用 、NMR 3.數(shù)據(jù)分析： PCA、 PLS、 ANN 4.代謝途徑分析：代謝輪廓分析和代謝組學分析,江南大學,19,The strategy for large scale metabonomics research,江南大學,20,樣品制備 微生物代謝物樣品的制備一般分為微生物培養(yǎng)、淬滅和代謝產物的提取。根據(jù)研究對象、目的

13、和采用的分析技術不同,所需的樣品提取和預處理方法各異，不存在一種普適性的標準化方法。 微生物代謝組學研究要求微生物的生長條件是可以控制和重復的。在一個生物反應器中，需要嚴格控制溫度、pH、培養(yǎng)基組成、溶解氧和二氧化碳等以明確界定生長條件，建立標準的和可重復的參考培養(yǎng)條件。微生物的培養(yǎng)可以以分批、補料或者連續(xù)培養(yǎng)模式進行。由于連續(xù)培養(yǎng)的菌體生理穩(wěn)定，易于控制且重現(xiàn)性較好，所以，大多數(shù)研究者傾向于應用生物反應器連續(xù)培養(yǎng)操作模式。,江南大學,21,在樣品淬滅和代謝物的提取過程中，應遵循的原則是： （1）淬滅工藝最好可以立即凍結細胞代謝 （2）在淬滅過程中要求細胞膜無明顯損傷，以免胞內代謝物外泄。 （

14、3）提取過程中應該盡可能多的提取胞內代謝物。 （4）代謝產物不應該遇到任何物理或化學修飾。 （5）得到的樣品基質應與所選擇的分析方法相容。 冷甲醇、液氮和熱乙醇是最常用的淬滅方法，而在提取方面由于特定的提取條件往往僅適合某些類化合物目前尚無一種能夠適合所有代謝產物的提取方法應該根據(jù)不同的化合物選擇不同的提取方法，并對提取條件進行優(yōu)化。,江南大學,22,對獲得的樣品中所有代謝物進行分析鑒定是代謝組學研究的關鍵步驟，也是最困難和多變的步驟。 與原有的各種組學技術只分析特定類型的物質不同，代謝組學分析對象的大小、數(shù)量、官能團、揮發(fā)性、帶電性、電遷移率、極性以及其他物理化學參數(shù)差異很大，要對它們進行無

15、偏向的全面分析，單一的分離分析手段往往難以保證。 色譜、質譜、核磁共振、紅外光譜、庫侖分析、紫外吸收、熒光散射、發(fā)射性檢測和光散射等分離分析手段及其組合都被應用于代謝組學的研究。,江南大學,23,江南大學,24,一般來說,選擇代謝物組學分析方法時,其原則是要同時考慮儀器和技術的檢測速度、選擇性和靈敏度,找到一種最適合目標化合物的方法。 化學分析技術中最常用的是1H核磁共振(1HNMR)以及色譜質譜聯(lián)用(X-MS)，如氣相色譜耦聯(lián)質譜(GC/MS)、液相色譜耦聯(lián)質譜(LC/MS)和毛細管電泳耦聯(lián)質譜聯(lián)用技術 (CE/MS)來分析研究代謝物并為其繪制圖譜。這些技術的耦聯(lián)可以提高對樣品的分辨率、敏感

16、性及選擇度,有利于對更多的生物體系內的代謝物繪制圖譜。,江南大學,25,GC/MS 、LC/MS和CE/MS 可以同時檢測出數(shù)百種化合物，包括糖類、有機酸、氨基酸、脂肪酸和大量不同的次生代謝物 。 GC/MS有很好的分離效率且相對較為經(jīng)濟，但需要對樣品進行衍生化預處理，這一步驟會耗費額外的時間，甚至引起樣品的變化。受此限制，GC/MS 無法分析膜脂等熱不穩(wěn)定性的物質和分子量較大的代謝產物。 近來，多維分離技術如二級氣相色譜飛行時間質譜（GC-GC-TOF-MS），檢測范圍更廣，但由于實際應用困難和花費較高等問題使其并未普遍使用。,江南大學,26,HPLC 與 GC 原理相似，但在進樣前不需進行

17、衍生化處理，適合那些不穩(wěn)定、不易衍生化、不易揮發(fā)和分子量較大的化合物。HPLC/MS 選擇性和靈敏度都較好，但分析的時間相對較長，且需依賴純的參照物。 CE-MS分離樣品效率比普通的色譜質譜聯(lián)用要高得多，僅需要極少的進液量nL），而且其測試時間短，試劑成本低。CE-MS在微生物代謝組領域發(fā)揮著越來越重要的作用。 色譜質譜連用技術具有分離效率高、靈敏度好及經(jīng)濟實用等優(yōu)點。但需要解決的主要問題是：大量色譜峰的識別問題以及方法的重現(xiàn)性問題。,江南大學,27,NMR是當前代謝組學研究中的主要技術 首先，不同于質譜具有離子化程度和基質干擾等問題，NMR 沒有偏向性，對所有化合物的靈敏度是一樣的；其次，N

18、MR 無損傷性，不破壞樣品的結構和性質，可在接近生理條件下進行實驗，可在一定的溫度和緩沖液范圍內選擇實驗條件，可以進行實時和動態(tài)的檢測；此外，NMR 氫譜的譜峰與樣品中各化合物的氫原子是一一對應的，所測樣品中的每一個氫原子在圖譜中都有其相關的譜峰，圖譜中信號的相對強弱反映樣品中各組分的相對含量，更為直觀 。因此，NMR 方法很適合研究代謝產物中的復雜成分。 與 GC/MS 和 LC/MS 相比， NMR 的缺點是靈敏度低，有可能形成信號重疊，且其對樣品制備的要求很高。同時因為動態(tài)范圍有限，很難同時測定生物體系中共存的濃度相差較大的代謝產物。,江南大學,28,數(shù)據(jù)分析平臺 在代謝組學研究中，大多

19、數(shù)是從檢測到的代謝產物信息中進行兩類(如基因突變前后的響應)或多類(如不同表型間代謝產物)的判別分類以及生物標記物的發(fā)現(xiàn)。由于生物樣品的組成復雜，在得到分析對象的原始譜圖后，首先需要對數(shù)據(jù)進行預處理(歸一化和濾噪)，消除干擾因素，保留有用信息。 數(shù)據(jù)的解析可分為如下3個基本步驟： (1)提取出色譜分離后未能有效分開的代謝物峰并得出其相應濃度； (2)根據(jù)其保留時間及質譜圖等信息鑒別有效峰所代表的化合物； (3)根據(jù)代謝數(shù)據(jù)建立代謝網(wǎng)絡模型。,江南大學,29,代謝組學分析得到的是信息含量豐富的多維數(shù)據(jù)，應用模式識別和多維統(tǒng)計分析等方法能從這些大量的數(shù)據(jù)中充分挖掘出其中的信息，這些方法能夠為數(shù)據(jù)降

20、維，使它們更易于可視化和分類。 目前數(shù)據(jù)分析常用的兩類算法是基于尋找模式的非監(jiān)督方法 (unsupervised method) 和有監(jiān)督方法 (supervised method)。 非監(jiān)督方法 是用來探索完全未知的數(shù)據(jù)特征的方法，對原始數(shù)據(jù)信息依據(jù)樣本特性進行歸類，把具有相似特征的目標數(shù)據(jù)歸在同源的類里，并采用相應的可視化技術直觀地表達出來。應用在此領域的常見方法有聚類分析 (cluster analysis) 和主成分分析 (principal components analysis，PCA) 等。,江南大學,30,聚類分析依據(jù)物以類聚的原理分析具有相似性的事物，將分類對象置于一個多維空

21、間中，根據(jù)事物彼此不同的屬性進行辨認，將性質相近的歸入一類，這樣歸在同一類的事物具有高度的相似性；聚類分析就是把事物按其相似程度進行分類，并找出每一類事物共同特征的分析工具。 具體到代謝組學中，被歸入一類的物質有相同的特征，可能有相同的功能作用，這樣通過同一類事物中一個研究較為清晰的物質可以推斷該類中其他物質的功能作用。聚類分析過程通?？煞譃橐韵虏襟E：數(shù)據(jù)收集并且收集相應的變量；產生一個相似矩陣；決定把目標總體細分為幾類，及其對每一種類別相應的定義；實施聚類分析，產生結果。,江南大學,31,主成分分析是目前應用最為廣泛的多維分析方法之一。PCA 的特點是將分散在一組變量上的信息集中到某幾個綜合

22、指標，即主成分 (principal component，PC) 上，利用這些主成分來描述數(shù)據(jù)集內部結構，實際上也起著數(shù)據(jù)降維的作用。 主成分是由原始變量按一定的權重經(jīng)線性組合而成的新變量。這些變量具有以下性質：1)每一個 PC 之間都是正交的；2)第1個 PC 包含了數(shù)據(jù)集的絕大部分方差，第2個次之，依此類推。這樣，由頭2個或3個 PC 作圖，就能夠很好地代表數(shù)據(jù)集所包含的生物化學變化,江南大學,32,有監(jiān)督方法如果存在一些有關數(shù)據(jù)的先驗消息和假設，有監(jiān)督方法比非監(jiān)督方法更適合且更有效。有監(jiān)督方法在已有知識的基礎上建立信息組 (class information)，并利用所建立的組對未知數(shù)據(jù)

23、進行辨識、歸類和預測。 在這類方法中，由于建立模型時有可供學習利用的訓練樣本，所以稱為有監(jiān)督學習。應用于該領域的常見方法有線性判別分析 (linear discrimination analysis)、偏最小二乘法-顯著性分析 (PLS-discrimination analysis) 和人工神經(jīng)元網(wǎng)絡 (artificial neural networks，ANN),江南大學,33,網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫在信息時代，代謝組學的分析離不開各種代謝途徑和升華數(shù)據(jù)庫，利用網(wǎng)絡資源進行研究是必不可少的，與基因組學和 蛋白組學已有較完善的數(shù)據(jù)庫供搜索使用相比，目前代謝組學研究尚無類似的功能完備數(shù)據(jù)庫。 DOME

24、(/dome.html) 有許多關于代謝物的原始數(shù)據(jù)和分析結果，分析結果用多維統(tǒng)計軟件處理后可用于 OMEs 的瀏覽器 (BROME) 瀏覽。 MetaCyc () 是一個關于代謝物的數(shù)據(jù)庫，闡述了超過150種生物體中的代謝途徑，包含了從大量的文獻和網(wǎng)上資源中得到的代謝途徑、反應、酶和底物的資料。MMP (http:/www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme) 對主要代謝途徑及涉及的關鍵酶進行了詳盡的描述。 ArMet () 是一個涵蓋大部分植物代謝

25、組學研究工作的網(wǎng)站，包含了這些工作開展的時間，甚至還有詳細的實驗步驟，并將代謝物信息標準化，以便于研究者交流。,江南大學,34,第三章 代謝組學的應用,代謝組學在微生物領域的應用 (一)微生物分類,突變體篩選以及功能基因研究 經(jīng)典的微生物分類方法多根據(jù)微生物形態(tài)學以及對不同底物的代謝情況進行表型分類。最近,隨著分子生物學的突飛猛進,基因型分類方法如16SrDNA測序,DNA雜交以及PCR指紋圖譜等方法得到了廣泛應用。然而,某些菌株按照基因型與表型兩類方法分類會得出不同的結果。因此,根據(jù)不同的分類目的聯(lián)合應用這兩類方法已成為一種趨勢。BIOLOG等方法在表型分類中應用較為廣泛,但是,代謝譜分析方

26、法(metabolic p rofiling)異軍突起,逐漸成為一種快速、高通量,全面的表型分類方法。,江南大學,35,采用代謝組分類時,可以通過檢測胞外代謝物來加以鑒別。常用的胞外代謝物檢測方法為樣品衍生化后進行GC2MS分析、薄層層析或HPLC2MS分析,最后通過特征峰比對進行分類。Bundy等采用NMR分析代謝譜成功地區(qū)分開臨床病理來源以及實驗室來源的不同桿菌(bacillus cereus)。 除了表型分類外,代謝組學數(shù)據(jù)可以應用于突變體的篩選。在傳統(tǒng)研究中的沉默突變體(即未發(fā)生明顯的表型變化的突變體)內,突變基因可能導致了某些代謝途徑發(fā)生變化,通過代謝快照(metabolic sna

27、p shot)可以發(fā)現(xiàn)該突變體并研究相應基因的功能。,江南大學,36,(二)發(fā)酵工藝的監(jiān)控和優(yōu)化 發(fā)酵工藝的監(jiān)控和優(yōu)化需要檢測大量的參數(shù),利用代謝組學研究工具可以減少實驗數(shù)量,提高檢測通量,并有助于揭示發(fā)酵過程的生化網(wǎng)絡機制,從而有利于理性優(yōu)化工藝過程。 Buchholz等采用連續(xù)采樣的方法研究了大腸桿菌在發(fā)酵過程中的代謝網(wǎng)絡的動力學變化。他們在葡萄糖缺乏的培養(yǎng)液培養(yǎng)的大腸桿菌中加入葡萄糖,并迅速混勻,按每秒45次的頻率連續(xù)取樣。利用酶學分析、HPLC/LC2MS等手段監(jiān)測樣品中多達30種以上的代謝物、核苷以及輔酶,從而解析了葡萄糖以及甘油的代謝途徑和底物攝取體系。通過統(tǒng)計學分析建模,發(fā)現(xiàn)在接

28、觸葡萄糖底物后的1525s范圍內,大腸桿菌體內發(fā)生的葡萄糖代謝物變化與經(jīng)典生化途徑相符,但隨后的過程則與經(jīng)典途徑不符,推測可能存在新的未知調控步驟。Takors認為,通過上述代謝動力學研究,掌握代謝途徑及網(wǎng)絡中的關鍵參數(shù),將直接有利于代謝工程的優(yōu)化,包括菌株的理性優(yōu)化以及發(fā)酵參數(shù)的調控。,江南大學,37,(三)環(huán)境微生物研究 微生物降解是環(huán)境中去除污染物的主要途徑。深入了解污染物在微生物內的代謝途徑,將有助于人們優(yōu)化生物降解的條件,從而實現(xiàn)快速的生物修復。這些代謝中間體大都通過萃取、分析方法進行逐個研究,并借助專家經(jīng)驗擬合出代謝途徑,其動力學過程亦很少觸及。代謝組學方法的采用有可能改變這一現(xiàn)狀

29、。 Boersma等采用代謝組學方法研究氟代酚的微生物降解途徑。氟代化合物具有特殊的19F核磁共振屬性,19F的核磁共振靈敏度與1H核相近;由于生物體內無內源性19F核磁信號,因而無本底干擾。所有19F核磁信號均可歸結于異生素及其代謝物。19F核的化學位移值寬,約為700ppm(1H為15ppm,13C為250ppm)。較寬的化學位移導致19 F在不同取代物的峰圖不易產生重疊。因此,借助核磁共振技術可以更方便地研究含氟化合物的代謝中間體。,江南大學,38,代謝生物學在藥物研發(fā)和疾病研究中的應用 代謝組學在疾病動物模型的確證、藥物的篩選、藥效及毒性評價、作用機制和臨床評價等方面有著廣泛的應用。

30、Nicholson 研究小組利用NMR代謝組學技術，在藥物毒性評價方面開展了深入研究，結果表明代謝組學方法可判斷毒性影響的組織器官極其位點，推測藥物相關作用機制確定與毒性有關的簽字生物標志物；變在此基礎上建立棵供毒性預測的專家系統(tǒng)及毒物影響動物內源性代謝物隨時間的變化軌跡。 代謝組學在疾病的研究中的應用主要包括病變標志物的發(fā)現(xiàn)、疾病的診斷、治療和愈后的判斷。 目前報道較多在疾病研究的應用，如新生兒的代謝紊亂、冠心病、膀胱炎、高血壓和精神系統(tǒng)疾病等。,江南大學,39,Nicholson及其工作組發(fā)現(xiàn)了給予氨基半乳糖的大鼠可以被分為有反應和無反應兩組，而這兩組動物可以根據(jù)它們在給藥前的尿代謝物來區(qū)

31、分，他們第一次提到藥物代謝組學的概念，并將其定義為“根據(jù)用藥前代謝產物的特點來預測對個人進行藥物或外來物的干預的結果”。,江南大學,40,NMR Acquisition and Gilson 215 Control System,NMR flow probe,N2 gas,Varian Inova 600 Shielded magnet 120 ul flow probe,Gilson 215 autosampler,Biomek Robot,Refrigerated Metabolism Cage (0o C.),Frozen Storage,+ NaN3,Deuterated Buffer,TSP,Data Processing,江南大學,41,Synthesis,Efficacy/HTS,Efficacy/In Vivo,Lead,TOX,IND,P1,P2,P3,Metabonomics in Drug Development,Preclinical E