1、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究方法介紹,堿性磷酸酶km值測(cè)定,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)環(huán)境因素對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響； 學(xué)習(xí)米氏方程及Km值得測(cè)定； 測(cè)量堿性磷酸酶km值； 實(shí)驗(yàn)原理 E的反應(yīng)速度受到環(huán)境因素的影響，這些因素包 括底物濃度、E濃度、PH、溫度、激活劑、抑止劑等,（一）米曼氏方程式,中間產(chǎn)物,酶促反應(yīng)模式中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō),相關(guān)E學(xué)原理,1913年Michaelis和Menten提出反應(yīng)速度與底物濃度關(guān)系的數(shù)學(xué)方程式，即米曼氏方程式，簡(jiǎn)稱米氏方程式(Michaelis equation)。,S：底物濃度 V：不同S時(shí)的反應(yīng)速度 Vmax：最大反應(yīng)速度(maximum velocity) m：米氏常數(shù)(Mich

2、aelis constant),當(dāng)反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時(shí),Km值的推導(dǎo),KmS,Km值等于酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度，單位是mol/L。,（二）Km與Vmax的意義,Km值 Km等于酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度。 意義： a) Km是酶的特征性常數(shù)之一； b) Km可近似表示酶對(duì)底物的親和力； c) 同一酶對(duì)于不同底物有不同的Km值。,Vmax 定義：Vm是酶完全被底物飽和時(shí)的反應(yīng)速度，與酶濃度成正比。,（三）m值與max值的測(cè)定,1. 雙倒數(shù)作圖法(double reciprocal plot)，又稱為 林-貝氏(Lineweaver- Burk)作圖法,

3、2. Hanes作圖法,在林貝氏方程基礎(chǔ)上，兩邊同乘S,S/V=Km/Vmax + S/Vmax,酶濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響,當(dāng)SE，酶可被底物飽和的情況下，反應(yīng)速度與酶濃度成正比。 關(guān)系式為：V = K3 E,雙重影響 溫度升高，酶促反應(yīng)速度升高；由于酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，溫度升高，可引起酶的變性，從而反應(yīng)速度降低 。,溫度對(duì)反應(yīng)速度的影響,最適溫度 (optimum temperature)： 酶促反應(yīng)速度最快時(shí)的環(huán)境溫度。,* 低溫的應(yīng)用,pH對(duì)反應(yīng)速度的影響,最適pH (optimum pH)： 酶催化活性最大時(shí)的環(huán)境pH。,堿性磷酸酶km值的測(cè)定,操作,混勻后，37水浴15min,以第6管調(diào)0與650nm比色，讀取各管A值。,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及結(jié)果,以上述數(shù)據(jù)雙倒數(shù)作圖，求出堿性磷酸酶的Km值。,實(shí)驗(yàn)討論,Km值的定義和意義是什么？ 米氏方程度表達(dá)式是什么，如何求出Vmax和Km？,現(xiàn)有某待測(cè)樣品液5ml，將其稀釋到100ml，取其稀釋液1ml加入測(cè)定管按酚試劑法測(cè)其蛋白質(zhì)含量，另取已知濃度的牛血清白蛋白溶液（250微克/ml）1ml加入標(biāo)準(zhǔn)管，其余操作同測(cè)定