1、生物學(xué)實驗教學(xué)中心,CO2培養(yǎng)箱使用,李 東,CO2培養(yǎng)箱,Wenzhou,Medical College,全世界的用戶對二氧化碳培養(yǎng)箱都有兩條最基本的要求，一是要求二氧化碳培養(yǎng)箱能夠?qū)囟?、二氧化碳濃度和濕度提供最精確穩(wěn)定的控制，以便于其研究工作的進(jìn)展；二是要求二氧化碳培養(yǎng)箱能夠?qū)ε囵B(yǎng)箱內(nèi)的微生物污染進(jìn)行有效的防范。,CO2培養(yǎng)箱使用注意事項,Wenzhou,Medical College,一、二氧化碳進(jìn)氣壓力：0.080.1 MPa ( 0.8-1 bar ) 壓力表選用：初級壓力25MPa，次級壓力0.2MPa 。松緊 壓力 低高。進(jìn)氣正常的現(xiàn)象。壓力過高的危害，注意安全。壓力調(diào)節(jié)穩(wěn)定需

2、要時間，原因：殘余氣體，壓力表不穩(wěn)。 二、溫度控制 培養(yǎng)箱的最低工作溫度一般是高于室溫5C ，空氣循環(huán)提高溫度均一性。溫度恢復(fù)時間（37），開門時間過長，超溫；水盤的水溫影響。門加熱系統(tǒng)，即使箱內(nèi)相對濕度高達(dá)98%，所有內(nèi)壁表面亦能保持完全干燥 。,CO2培養(yǎng)箱使用注意事項,Wenzhou,Medical College,CO2培養(yǎng)箱使用注意事項,Wenzhou,Medical College,CO2培養(yǎng)箱使用注意事項,Wenzhou,Medical College,幻燈片 3,CO2培養(yǎng)箱使用注意事項,Wenzhou,Medical College,三、二氧化碳濃度控制 按培養(yǎng)基中的NaHC

3、O3設(shè)定二氧化碳濃度：NaHCO3 1.97g/L ，CO2濃度5% ； NaHCO3 3.95g/L， CO2 10% 。RPMI1640培養(yǎng)基每升2.1g碳酸氫鈉；DMEM每升3.7克碳酸氫鈉；F12 NaHCO3 1.18g/L ;DMEM/F12 NaHCO3 2.56 g/L 。 HEPES 緩沖液可與低水平的碳酸鈉（0.34g/L）共用，以抵消因額外加入HEPES 引起的滲透壓增加。在這種培養(yǎng)條件下，細(xì)胞培養(yǎng)瓶的蓋子應(yīng)擰緊，以防止培養(yǎng)液中所需的少量碳酸鹽散入空氣中。 注意,CO2培養(yǎng)箱使用注意事項,Wenzhou,Medical College,四、相對濕度 水盤蒸發(fā)面積大，增強蒸

4、發(fā)作用，使培養(yǎng)箱內(nèi)能快速達(dá)到飽和濕度狀態(tài)。無菌蒸餾水，定期檢查、定期更換。 二氧化碳培養(yǎng)箱停止使用時，除水，否則發(fā)霉。,CO2培養(yǎng)箱使用注意事項,Wenzhou,Medical College,五、防污染和消毒滅菌 空氣過濾：HEPA過濾器能過濾培養(yǎng)箱內(nèi)空氣，可過濾除去99.97%的0.3微米以上的顆粒，箱體關(guān)閉后5分鐘內(nèi)達(dá)到空氣100級。乙醇消毒。 紫外消毒：紫外消毒能力是與紫外燈距離目標(biāo)的距離的二次方成反比，距離越遠(yuǎn)，消毒能力越差，且無穿透能力，難以達(dá)到徹底滅菌的要求； 高溫濕熱：目前比較有效消毒滅菌的方法，高溫消毒又分為兩類，一是傳統(tǒng)的高溫干熱消毒，另一種是先進(jìn)的高溫濕熱滅菌。,CO2培

5、養(yǎng)箱使用注意事項,Wenzhou,Medical College,六、重要提示 需要定時更換的部件：HEPA過濾器、空氣過濾器 需要定時處理的工作：消毒、水盤,CO2培養(yǎng)箱使用注意事項,Wenzhou,Medical College,幻燈片 3,細(xì)胞培養(yǎng)室,細(xì)胞培養(yǎng)室,Wenzhou,Medical College,無菌級別：萬級，局部100 級 Nikon 倒置生物顯微鏡 Nikon DS-5M-L1顯微攝影系統(tǒng) Thermo二氧化碳培養(yǎng)箱 Labsystems BioMate電動移液器,細(xì)胞培養(yǎng)室使用注意事項,Wenzhou,Medical College,細(xì)胞培養(yǎng)室的大小依需要而定，一般

6、由更衣間、緩沖間和操作間三部分組成。更衣間放在外，主要供更換衣帽、鞋子等。緩沖間位于更衣間與操作間之間，也可同時和幾個操作間相通。操作間放在內(nèi)間，主要供無菌操作和細(xì)胞培養(yǎng)，房間應(yīng)不受日光直射，大小適當(dāng)，高度適宜(2.5m)。房間過大，清掃和消毒不便；過小，操作不便；頂部過高會影響紫外線的有效滅菌效果。墻壁應(yīng)光滑無死角，以便清洗和消毒。,細(xì)胞培養(yǎng)室使用注意事項,Wenzhou,Medical College,細(xì)胞培養(yǎng)室的日常維護(hù)和操作規(guī)程： 、日常維護(hù) 1、定期打掃無菌室：每周打掃一次，先用自來 水擦地、擦桌子、超凈工作臺等，然后用3 來蘇爾或者新潔爾滅擦拭。 2、無菌室實驗前滅菌：打開紫外燈、

7、空氣凈化 器系統(tǒng)30分鐘。 3、無菌室實驗后滅菌：用75酒精擦拭超凈臺 （有機玻璃面板不能用酒精擦拭）、邊臺、倒 置顯微鏡的載物臺，打開紫外燈照射30分鐘。,細(xì)胞培養(yǎng)室使用注意事項,Wenzhou,Medical College,、進(jìn)入無菌室的實驗人員無菌準(zhǔn)備： 1、肥皂洗手，75酒精泡手。 2、帶好手套、穿好隔離衣、拖鞋、帶 好隔離帽、口罩。 3、用75酒精棉球擦凈雙手（酒精不 可過多，防止著火）。,細(xì)胞培養(yǎng)室使用注意事項,Wenzhou,Medical College,、無菌室內(nèi)的操作要求和注意事項： 1、凡是帶入無菌室的試劑（酒精、PBS、培養(yǎng)基、 胰蛋白酶等）的瓶子均要用75酒精擦拭瓶

8、 子的外表面。 2、動作要輕、準(zhǔn)確，不能亂碰。如吸管不能碰到 廢液缸、手。 3、吸取兩種以上的試劑時要注意更換吸管，防止 交叉污染。 4、不同細(xì)胞培養(yǎng)瓶（板）內(nèi)使用的吸管要注意更 換，防止污染擴大。,細(xì)胞培養(yǎng)室使用注意事項,Wenzhou,Medical College,誤區(qū)：紫外燈消毒滅菌時間 。消毒的效能與距離成反比，進(jìn)行空氣消毒時燈管應(yīng)距地面25 m以內(nèi)；臺面的消毒應(yīng)在80 cm以內(nèi)；培養(yǎng)器皿的消毒在30 cm以內(nèi)。 消毒的時間與效能存在一定關(guān)系，但不是絕對的：照射20 min后，有71的細(xì)菌被消滅；40 min后79的細(xì)菌被消滅；60 min后86的細(xì)菌被消滅。紫外線照射時間再長也不是

9、100的滅菌，最多只能把90的細(xì)菌消滅，過長的照射是沒有意義的。如用于紫外線照射帶菌的器皿，應(yīng)與其他消毒方法結(jié)合使用，如先用75的酒精浸泡，再照紫外線消毒滅菌等。,細(xì)胞培養(yǎng)室使用注意事項,Wenzhou,Medical College,誤區(qū)：鼓風(fēng)機風(fēng)速要適當(dāng)。超凈工作臺注意過濾器的效果，一般2-3年更換一次，以保持過濾器的凈化效果。 廢液缸處理。 及時關(guān)閉空氣循環(huán)器 及時關(guān)閉空調(diào),光學(xué)顯微鏡的使用,李 東 生物學(xué)實驗教學(xué)中心,、普通光學(xué)顯微鏡,顯微鏡的構(gòu)造主要分為三部分：機械部分、照明部分和光學(xué)部分,、普通光學(xué)顯微鏡,顯微鏡清晰度決定于放大倍數(shù)和顯微鏡的分辨力，分辨力是指顯微鏡（或人的眼睛距目

10、標(biāo)25cm處）能分辨物體最小間隔的能力，分辨力的大小決定于光的波長和鏡口率以及介質(zhì)的折射率，用公式表示為：R=0.61 /N.A ， N.Asin/2 介質(zhì)的折射率:空氣(1)水(1.33)香柏油(1.515) 光學(xué)鏡頭所用的玻璃折射率為1.651.78，所用介質(zhì)的折射率越接近玻璃的越好。對于干燥物鏡來說，介質(zhì)為空氣，鏡口率一般為0.050.95；油鏡頭用香柏油為介質(zhì)，鏡口率可接近1.5。 普通光線的波長為400700nm，因此顯微鏡分辨力數(shù)值不會小于0.2m，人眼的分辨力是0.2mm，所以一般顯微鏡設(shè)計的最大放大倍數(shù)通常為1000X 。,二、熒光顯微鏡,二、熒光顯微鏡,熒光顯微鏡濾色片參數(shù)

11、MWU:波長330385nm 高通濾色片：420nm MWB(藍(lán)光激發(fā)):波長450480nm 高通濾色片：515nm 觀察綠色熒光的樣品， 例：FITC（激發(fā)490 nm，熒光波長520 nm） EB： 激發(fā)波長488 nm, 發(fā)射波長620 nm （RNA ，DNA ：紅色；可進(jìn)入死細(xì)胞 ） AO PI： 激發(fā)波長495 nm，發(fā)射波長530 nm （DNA ：綠色；RNA：紅色；可進(jìn)入活細(xì)胞）WIG(綠光激發(fā)):波長510550nm 高通濾色片：590nm 觀察紅色熒光的樣品,二、熒光顯微鏡,熒光顯微鏡和普通顯微鏡的區(qū)別： 照明方式通常為落射式，即光源通過 物鏡投射于樣品上； 2. 光源

12、為紫外光，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡； 3. 有兩個特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見光，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，用以保護(hù)人目。,三、倒置相差顯微鏡,可以觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞。相差顯微鏡的基本原理是，把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。 光線透過標(biāo)本后發(fā)生折射，偏離了原來的光路，同時被延遲了1/4（波長），如果再增加或減少1/4，則光程差變?yōu)?/2，兩束光合軸后干涉加強，振幅增大或減小，提高反差。,三、倒置相差顯微鏡,三、倒置相差顯微鏡,相差顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡的不同點： 1、 環(huán)形光闌位于光源與聚光器之間，作用是使透

13、過聚光器的光線形成空心光錐，焦聚到標(biāo)本上。 2、相位板（annular phaseplate）在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4。分為兩種： 1、 A+相板：將直射光推遲1/4，兩組光波合軸 后光波相加，振幅加大，標(biāo)本結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變亮，形成亮反差（或稱負(fù)反差）。 2.、 B+相板：將衍射光推遲1/4，兩組光線合軸后光波相減，振幅變小，形成暗反差（或稱正反差），結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變暗。,用比色法測定細(xì)胞相對數(shù),Wenzhou,Medical College,取有貼壁細(xì)胞培養(yǎng)板的，每孔內(nèi)加入5mg/ml 20l，4后每孔加入50%二甲亞砜水溶液150L，振蕩1

14、0 Min，570 nm(或490nm)處測定OD值，作為細(xì)胞相對數(shù)。 注意：MTT法只能測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力，不能測定細(xì)胞絕對數(shù)。,制備細(xì)胞爬片,Wenzhou,Medical College,1、在無菌培養(yǎng)皿或6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中鋪上滅菌 后的蓋玻片，在每片蓋玻片上滴一滴計數(shù) 后的細(xì)胞懸液（細(xì)胞密度為2104/ml）。 再在每片蓋玻片上滴加培養(yǎng)液至剛好覆蓋 滿蓋玻片。將培養(yǎng)皿（6孔細(xì)胞培養(yǎng)板） 置于 37，含 5% CO2及飽和濕度的 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 2、4小時后將培養(yǎng)液加量至覆蓋整個培養(yǎng)皿的 底面。,制備細(xì)胞爬片,Wenzhou,Medical College,3、倒置顯微鏡下觀察

15、，當(dāng)細(xì)胞增殖到合適的 密度后取出培養(yǎng)皿中止培養(yǎng)（一般為3-5 天）。 4、傾去培養(yǎng)液，加 PBS（PH 7.27.4）洗 滌細(xì)胞爬片 2 次，每次 1 min。 5、加 10%中性甲醛（或-20預(yù)冷的丙酮） 固定 1015min。 6、吸除固定液，加 PBS 再洗滌細(xì)胞爬片 2 次，每次 1 min。,制備細(xì)胞爬片,Wenzhou,Medical College,7、置于室溫下干燥1小時，如暫不染色，先放在-20 冰箱中保存。 8、取出蓋玻片時注意蓋玻片的正反面（有細(xì)胞的為正面）。,細(xì)胞爬片的免疫化學(xué)染色法,Wenzhou,Medical College,1、在細(xì)胞爬片上加0.03% Trit

16、on X-100 水溶液處理15min。（若是要檢測的抗原表達(dá)于胞漿，此步可考慮省略） 2、 吸除0.03% Triton X-100，加3%H2O2 孵育10min。 3、 吸除3%H2O2，加2%牛血清白蛋白封閉3060min。PBS 洗5min。,細(xì)胞爬片的免疫化學(xué)染色法,Wenzhou,Medical College,4、 吸除PBS，分別滴加相應(yīng)的一抗（用含1%牛血清白蛋白的PBS 液稀釋到合適滴度），置于37孵育1h，或置于4冰箱中過夜。陰性對照片此步用PBS 替代一抗。 5、 吸去一抗，PBS 漂洗3 次，每次5min。滴加山羊抗鼠的IgG 抗體-HRP多聚體，37孵育30min。,細(xì)胞爬片的免疫化學(xué)染色法,Wenzhou,Medical College,6、 PBS 漂洗3 次，每次5min。新鮮配制DAB 顯色液，滴加后作用35min，置于顯微鏡下觀察染色結(jié)果。 7、 雙蒸水漂洗后，滴加蘇木精染液，染色10min。 8、 雙蒸水漂洗后，滴加