1、第三章 細胞生物學(xué)研究方法,西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 馮全義,主要內(nèi)容,第一節(jié) 細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法 第二節(jié) 細胞組分的分析方法 第三節(jié) 細胞培養(yǎng)細胞工程與顯微操作技術(shù),第一節(jié) 細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法,一 光學(xué)顯微鏡技術(shù) 1、根據(jù)光源不同，可分為: 1）、光學(xué)顯微鏡： 以可見光（或紫外光）為光源 2）、電子顯微鏡： 以電子束為光源,光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下的細胞結(jié)構(gòu),2、分辨率(resolution),R = 0.61/n Sin n=介質(zhì)的折射率 ；空氣為1. 油為1.5 =樣品對物鏡角孔徑的半角；sin的最大值為1 =照明光源的波長 0.61是一個恒定的參數(shù)；表示成像的點雖被重疊但仍能被區(qū)別

2、的程度 分辨率概念：是指能區(qū)分兩個物點間最小距離的能力 分辨距離越小，分辨率越高，即分辨細微結(jié)構(gòu)的能力越大 提高分辨能力的方法： 改變n： n越大； R越??；分辨能力好 改變：越小；R越?。环直婺芰?2、放大率,最終成像的大小與原物體大小的比值 總放大率=物鏡放大率目鏡放大率 例如：目鏡10X；物鏡40X；則總放大率400X 注意分辨率與放大率的區(qū)分,電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別,3、普通光學(xué)顯微鏡構(gòu)成,照明系統(tǒng)： 光源、聚光器 光學(xué)放大系統(tǒng)：物鏡、目鏡組成；為了消除球差和色差 機械裝置： 用于固定材料和觀察方便 雙筒顯微鏡 ：亮度較單筒暗；雙眼觀察立體感較單筒強,雙筒顯微鏡,單筒顯微鏡

3、,（二）、熒光顯微鏡(fluorescence microscope),1、工作原理： 利用紫外線光源(如弧光燈、水銀燈等發(fā)出) 通過照明設(shè)備把切片或活染細胞透視出來 1）自發(fā)熒光 細胞中有些物質(zhì)（如葉綠素等）紫外線照射后可發(fā)熒光 2）誘發(fā)熒光 一些物質(zhì)紫外線照射后不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光,熒光顯微鏡照片（微管呈綠色、微絲紅色、核藍色）,2、熒光顯微鏡和普通顯微鏡的區(qū)別,1）照明方式： 通常為落射式，即光源通過物鏡投射于樣品上 2）光源： 為紫外光，波長較短，分辨力高 3） 特殊的濾光鏡系統(tǒng)片 激發(fā)濾色鏡（exciter filter）： 光源前的用

4、以濾除不需要的光線 UV（紫外）；V（紫）；B（藍）；G（綠） 阻斷濾色鏡（barrier filter）： 目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，保護眼睛,落射式照明原理,熒光顯微鏡的光通路,尼康E800熒光顯微鏡,其它類型的顯微鏡,（三）、激光共聚焦掃描顯微境(laser confocal scanning microscope ) 用激光作掃描光源，逐點、逐行、逐面掃描成像 分辨力較高，是普通光鏡的3倍,激光共聚焦掃描顯微鏡,LCSM照片 藍色為細胞核，綠色為微管,（四）、暗視野顯微鏡,暗視野顯微鏡(dark field microscope) 用特殊的聚光器使照明光線不能進入物鏡被放大 在黑

5、暗的背景下呈現(xiàn)明亮的像 反差增大，分辨率提高 觀察未經(jīng)染色的活體或膠體粒子,（五）、相差顯微鏡,相差顯微鏡（phasecontrast microscope） 荷蘭人Zernike1932年發(fā)明，獲1953年諾貝爾物理獎 作用：可觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細胞 基本原理：把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，而提高結(jié)構(gòu)間的對比度,入射光環(huán),（六）、偏光顯微鏡（polarizing microscope） 檢測有雙折射性的物質(zhì)，如纖維絲、紡錘體等 光源前有偏振片（起偏器），使進入顯微鏡的光線為偏振光 （七）、微分干涉差顯微鏡（differential interference contrast mi

6、croscope） 1952年，Nomarski在相差顯微鏡原理的基礎(chǔ)上發(fā)明 DIC顯微鏡又稱Nomarski相差顯微鏡（Nomarki contrast microscope） 利用的偏振光 ;標(biāo)本可略厚，折射率差別更大 基因注入、核移植、轉(zhuǎn)基因等的顯微操作,（八）、倒置顯微鏡,倒置顯微鏡特點: 物鏡與照明系統(tǒng)顛倒 觀察培養(yǎng)的活細胞 具有相差物鏡,萊卡倒置顯微鏡,一般光學(xué)顯微鏡的樣品制備與觀察,1、 樣品的固定(fixation) 目的: 1)殺死細胞，穩(wěn)定細胞的化學(xué)成份 2)使樣品在后面的處理和切片時不受到破壞 做法: 最簡單是直接浸泡在固定液中 一般用有緩沖作用的醛類固定液，(甲醛或戊二

7、醛) 醛類固定液作用機理： 能夠與蛋白質(zhì)的游離氨基形成共價鍵，而將鄰近的蛋白質(zhì)分子交聯(lián)一起,2、包埋和切片(embedding and sectioning) 包埋: 常用包埋劑:液態(tài)的石蠟或樹脂 使之滲入整塊組織，后將之硬化成固體的包埋塊 切片： 切片機切割包埋塊，制備成薄切片 適用于光學(xué)顯微鏡觀察的切片厚度為 l10 m,切片機進行樣品切片,3、染色(staining)： 目的: 給細胞的不同組分帶上可區(qū)別的顏色特征 一些典型的有機染料 蘇木精(hematoxylin): 能顯示出細胞內(nèi)核酸的分布 伊紅(eosin):可使細胞質(zhì)染色 蘇丹染料(Sudan dyes)的乙醇飽和溶液:能使脂肪

8、著色 4、有些過程需進行脫水處理,二、電子顯微鏡(electron microscope),1、發(fā)明 1932年德國人Max Knolls和Ernst Ruska發(fā)明第一臺電子顯微鏡,光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下的細胞結(jié)構(gòu),2、電鏡分類 透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM) 掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy，SEM),光鏡與透射電鏡的結(jié)構(gòu),光學(xué)顯微鏡、TEM、SEM成像原理比較,3、透射電子顯微鏡基本結(jié)構(gòu),三大部分組成 1、電子光學(xué)系統(tǒng)(鏡筒)： 照明系統(tǒng)、樣品室、成像系統(tǒng)、觀察窗和記錄用的照相機等 2、

9、真空系統(tǒng)： 作用： 防止：陰極與陽極之間會放電， 燈絲也會因受到氧化或被陽離子轟擊而縮短壽命 3、電子學(xué)系統(tǒng)(供電系統(tǒng)) 供電系統(tǒng)，需要高壓穩(wěn)壓 TEM的分辨力可達0.2nm 超薄切片：電子束的穿透力很弱 標(biāo)本厚度約50nm的超薄切片,4、透射電鏡制樣技術(shù),1）固定樣品： 鋨酸（OsO4）和戊二醛 2）包埋及超薄切片： 以環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進的方式推進樣品切片，切片厚度2050nm 3）負染色技術(shù) 用重金屬鹽（如磷鎢酸、醋酸雙氧鈾）對鋪展在載網(wǎng)上的樣品進行染色；吸去染料，樣品干燥后 樣品凹陷處：薄層重金屬鹽 樣品凸出處：沒有染料沉積，而出現(xiàn)負染效果,4）冰凍斷裂與冰凍蝕刻技術(shù),1、

10、標(biāo)本置于-100C的干冰或-196C的液氮中，進行冰凍 2、后用冷刀驟然將標(biāo)本斷開，升溫后，冰在真空條件下迅即升華，暴露出斷面結(jié)構(gòu)，稱為蝕刻（etching） 3、蝕刻后，向斷面以45度角噴涂一層蒸汽鉑，再以90度角噴涂一層碳，加強反差和強度 4、后用次氯酸鈉溶液消化樣品，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復(fù)膜（replica） 5、復(fù)膜顯示出了標(biāo)本蝕刻面的形態(tài)，在電鏡下得到的影像即代表標(biāo)本中細胞斷裂面處的結(jié)構(gòu),冰凍蝕刻電鏡照片,5、掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM，）,1）組成 掃描電子顯微鏡主要由電子光學(xué)系統(tǒng)和顯示單元組成,2）工作原理：,A：用細

11、的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子 次級電子的多少與樣品的表面結(jié)構(gòu)有關(guān) B：次級電子由探測體收集，并被閃爍器轉(zhuǎn)變?yōu)楣庑盘?C：再經(jīng)光電倍增管和放大器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘杹砜刂茻晒馄辽想娮邮膹姸?，顯示出與電子束同步的掃描圖像 圖像為立體形象，反映了標(biāo)本的表面結(jié)構(gòu),3）標(biāo)本制作： 為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號 目前掃描電鏡的分辨力為610nm,（三）、掃描隧道顯微鏡(scanning tunneling microscope，STM),1、發(fā)明 IBM公司瑞士蘇黎世研究所Binning G.和Rohrer H.等

12、在1981年發(fā)明 具有原子顯像力的顯微鏡，是根據(jù)量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)原理而制成的 1986年獲得了諾貝爾物理學(xué)獎,第二節(jié) 細胞組分的分析方法,第一部分 細胞分離技術(shù) 一、離心技術(shù) 1、應(yīng)用領(lǐng)域 研究如細胞核、線粒體、高爾基體、溶酶體和微體，以及各種大分子基本手段 高速離心機： 轉(zhuǎn)速為1025Kr/min的離心機轉(zhuǎn)速 超速離心機： 轉(zhuǎn)速超過25Kr/min，離心力大于89K的離心機,2、離心方法分類,（一）、差速離心 （differential centrifugation） （二）、密度梯度離心 （density gradient centrifugation）,（一）、差速離心（differ

13、ential centrifugation）,在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心 用于分離不同大小的細胞和細胞器 在差速離心中細胞器沉降的順序依次為：核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體,差速離心的原理,（二） 、密度梯度離心,1、（density gradient centrifugation）原理： 用一定的介質(zhì)在管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細胞分層、分離 2、常用的介質(zhì)：為氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖 3、分離活細胞的介質(zhì)要求： 1）能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時，粘度不高 2）PH中性或易調(diào)為中性

14、3）濃度大時滲透壓不大 4）對細胞無毒 4、分為：1）速度沉降（梯度沉降） 2）等密度沉降,1、速度沉降（梯度沉降） （velocity sedimentation） 1）主要用于： 分離 密度相近而大小不等的細胞或細胞器 2）要求 采用的介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度 生物顆粒（細胞或細器）在十分平緩的密度梯度介質(zhì)中各自以不同的速度沉降,2、等密度沉降（isopycnic sedimentation） 1）適用于： 分離密度不等的顆粒 2）原理 細胞或細胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和足夠長時間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處，從而將不同密度的細胞或細胞

15、器分離 3）要求 通常在較高密度的介質(zhì)中進行 介質(zhì)的最高密度應(yīng)大于被分離組分的最大密度 介質(zhì)的梯度要求較高的陡度，不能太平緩 常需要高速或超速離心，離心時間也較長,二、流式細胞術(shù)（flow cytometer）,1、用途：單個細胞進行快速定量分析與分選 2、基本原理： 包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴-形成含單個細胞的液滴-在激光束照射下，細胞發(fā)出散射光和熒光-經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計算機處理，輸出統(tǒng)計結(jié)果,第二部分：生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù),一、細胞化學(xué)技術(shù) 利用染色劑可同細胞的某種成分發(fā)生反應(yīng)而著色的原理，對某種成分進行定性或定位研究的技術(shù)。 顯示細胞的成分：無機物、醛、蛋

16、白質(zhì)、糖類、脂類、核酸、酶等 （一）、固定： 1物理固定：如空氣快速干燥、冷凍干燥或直接冷凍切片。 2化學(xué)固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和鋨酸等,（二）、顯示方法,1.金屬沉淀法： 如磷酸酶分解磷酸酯底物后，產(chǎn)物最終生成CoS或PbS有色沉淀，而顯示出酶活性 2.偶氮偶聯(lián)法： 酚類化合物與偶氮染料結(jié)合后可以形成耐曬染料 3.Schiff反應(yīng)： 細胞中的醛基可使Schiff試劑中的無色品紅變?yōu)榧t色。常用于顯示脫氧核糖核酸（Feulgen反應(yīng)）,4.聯(lián)苯胺反應(yīng)： 過氧化物酶分解H202，產(chǎn)生新生氧，氧再將無色的聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍，進而變成棕色化合物 5.普魯士藍反應(yīng)： Fe3與酸性亞鐵氰

17、化鉀作用，形成普魯士藍 6.脂溶染色法： 蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色 7.茚三酮反應(yīng)： 顯示蛋白質(zhì),二、免疫細胞化學(xué),1、原理： 利用抗體同特定抗原專一結(jié)合，對抗原進行定位測定的技術(shù)。 2、常用的標(biāo)記物：熒光素和酶 A常用的螢光素： 異硫氰酸熒光素、羅丹明等 B常用的酶： 辣根過氧化物酶，酶與底物發(fā)生反應(yīng)后形成不透明的沉積物，而顯示出抗原存在的部位,3、常用方法 據(jù)抗體與抗原的結(jié)合方法分為： 1：直接法： 是將帶有標(biāo)記的抗體與抗原反應(yīng)，顯示出抗原存在的部位 2、間接法： 是在抗體抗原初級反應(yīng)的基礎(chǔ)上，再用帶標(biāo)記的次級抗體同初級抗體反應(yīng)，從而使初級反應(yīng)得到放大，顯示增強,三、顯微光譜分析技術(shù),

18、1、原理 細胞中有一些成分具有特定的吸收光譜，其都有自己特征性的吸收曲線，利用顯微分光光度計對某些成分進行定位、定性，甚至定量測定 例如： 核酸的吸收波長為260nm 蛋白質(zhì)的吸收波長為280nm。,四、放射自顯影術(shù),1、用途 研究標(biāo)記化合物在機體、組織和細胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機理、作用部位等等 2、原理: 將放射性同位素（如14C和3H）標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)-經(jīng)一段時間后，將標(biāo)本制成切片或涂片，涂上鹵化銀乳膠-經(jīng)放射性曝光，組織中的放射性即可使乳膠感光-然后經(jīng)過顯影、定影處理顯示還原的黑色銀顆粒-即可得知標(biāo)本中標(biāo)記物的準確位置和數(shù)量 實驗室一般常選用14C和3H標(biāo)記

19、,五、分子雜交技術(shù),1、原理: 具有互補核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當(dāng)條件下，通過氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子 來測定單鏈分子核苷酸序列間是否有互補關(guān)系,（一）、原位雜交 （in situ hybridization） 用來檢測染色體上的特殊DNA序列 使用帶放射性的DNA探針(或熒光物質(zhì))，通過放射自顯影來顯示位置,人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交,(二）、基因克隆(gene cloning) 可概括為分、切、連、轉(zhuǎn)、選 兩個最基本的特點:分子水平上的操作和細胞水平上的表達,DNA的分子操作,六、PCR技術(shù),聚合酶鏈式反應(yīng)（poly