1、第二章DNA重組技術與基本操作,限制性內(nèi)切酶 克隆載體 重組基因的導入和篩選 獲得真核生物目的基因的方法,基因工程研究的理論依據(jù),不同基因具有相同的物質(zhì)基礎 基因是可以切割的 基因是可以轉移的 多肽與基因之間存在對應關系 遺傳密碼是通用的 基因可以通過復制把遺傳信息傳遞給下一代,DNA重組技術要有四個必要條件：,工具酶、 基因、 載體、 受體細胞,DNA限制性內(nèi)切酶可分為三類： 、 、酶在基因工程中基本不用,why?,第一節(jié)限制性內(nèi)切酶,限制性內(nèi)切酶是從細菌中分離提純的核酸內(nèi)切酶，可以識別并切開核酸序列特定位點分子手術刀 Arber、Smith和Nathans因為在發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶方面開創(chuàng)性工

2、作而共同獲得了1978年的諾貝爾獎。,、限制性內(nèi)切酶在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依賴于ATP的限制性內(nèi)切酶活性。 類酶結合于特定的識別位點，但卻沒有特定的切割位點，酶對其識別位點進行隨機切割，很難形成穩(wěn)定的、特異性切割末端。 類酶在識別位點上切割DNA，然后從底物上解離下來。,核酸內(nèi)切限制酶的類型及其主要特性,一、II類限制性內(nèi)切酶的特點,識別特定的核苷酸序列，其長度一般為4、5或6個核苷酸且呈二重對稱，但有少數(shù)酶識別更長的序列或兼并序列； 具有特定的酶切位點 ，產(chǎn)生出特定的酶切末端5突出粘末端、3突出粘末端、平末端； 類限制修飾系統(tǒng)是由兩種酶分子組成的二元系統(tǒng)；限制性內(nèi)切酶、獨立的甲基化

3、酶。,被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，它們之間正好互補配對，這樣的切口叫做 粘性末端。,EcoRI特異識別GAATTC及其互補堿基組成的雙鏈片段,Sma特異識別CCCGGG,形成平末端,二、使用限制性內(nèi)切酶時應注意的問題,1、仔細查閱酶的識別序列和切割位點。 同裂酶：不同來源但是識別同樣順序和相同切割位點的限制性內(nèi)切酶。 同尾酶：有時有兩種限制性內(nèi)切酶識別不同的核苷酸序列，但切割后DNA分子所產(chǎn)生的粘性末端卻相同，這類酶為具不同酶切位點的DNA片段重組提供了方便，但要注意，往往相容的粘性末端再用DNA連接酶連接后，都不能再被其切割了。,2、注意酶反應條件，相同反應條件

4、的酶可以同時酶解DNA樣品。 3、注意說明書中所列出的comments的內(nèi)容，會提供有關限制性內(nèi)切酶識別序列中位點特異性甲基化的信息以及引起酶產(chǎn)生star activity的原因。,star activity：指當酶的反應條件改變時，其在識別序列中的酶切位點發(fā)生改變。 產(chǎn)生的原因：反應體系中甘油的濃度12；酶：DNA比率25u/g；缺少Nacl和存在Mn2。,4、注意酶的濃度，酶切時不是酶加得越多越好。 一般以在20l反應體積中，37，每小時水解1微克DNA的酶量定為一個酶單位。 5、注意酶在保溫過程中的活性變化。 ACC在5 小時內(nèi)具有全部活力 BamH在第一個小時內(nèi)具有全部活力，在第二小時

5、具有部分活力，而在2小時以后就無活力了。 Cfo僅在第一個小時內(nèi)具有全部活力，一個小時以后就沒有活力了。,三、連接酶 定義：用于將兩端乃至數(shù)段DNA片段拼接起來的酶。 用途： （1）、連接帶匹配粘末端的DNA分子； （2）、使平末端的雙鏈DNA分子相互連接或與合成的寡核苷酸接頭相連接。 這類反應要比粘末端之間連接慢得多，但單價陽離子（150-200mmol/LNacl）或低濃度的聚乙二醇（PEG）可提高連接效率。,DNA連接酶,連接的部位：磷酸二酯鍵（梯子的扶手），不是氫鍵（梯子的踏板）。,四、修飾酶,1、DNA聚合酶： 大腸桿菌DNA聚合酶I，大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（klenow fr

6、agment）、T4噬菌體DNA聚合酶、T7噬菌體DNA聚合酶、耐高溫DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）、反轉錄酶、末端脫氧核苷酸轉移酶等 2、依賴于DNA的RNA聚合酶： SP6噬菌體及T7和T3噬菌體RNA聚合酶 用途:在in vitro條件，合成單鏈RNA作為雜交探針。,3、T4噬菌體多核苷酸激酶： 催化ATP的磷酸基轉移至DNA或RNA片段的5末端。 用途：標記DNA片段的5端，制備雜交探針；基因化學合成中，寡核苷酸片段5磷酸化；用于測序引物的5標記。,532 P,OH 3,HO,32P,3,5,32P ATP,4、堿性磷酸酶： 用途： 去除DNA片段5末端的磷酸，以防止在重組中自身

7、環(huán)化，從而提高重組效率； 在用32pATP標記DNA或RNA的5末端前，去除DNA或RNA片段的非標記的5磷酸。,5 P,OH 3,HO,P,3,5,5突出末端,5隱蔽末端,OH,HO,5HO,OH 3,3,5,第二節(jié)克隆載體,基因工程載體應具備的條件： 能自我復制并能帶動插入的外源基因一起復制； 具有合適的限制性內(nèi)切酶位點： 在載體上單一的限制性酶切位點越多越好，這樣可以將不同限制性內(nèi)切酶切割后的外源DNA片段方便的插入載體； 在細胞內(nèi)拷貝數(shù)要多，這樣才能使外源基因得以擴增； 載體的分子量要小，這樣可以容納較大的外源DNA插入片段： 在細胞內(nèi)穩(wěn)定性高，這樣可以保證重組體穩(wěn)定傳代而不易丟失；

8、應該有一個或多個選擇標記。,大腸桿菌表達載體應具備： 強的啟動子，一個強的可誘導的啟動子可使外源基因有效的轉錄； 在啟動子下游區(qū)和ATG（起始密碼子）上游區(qū)有一個好的核糖體結合位點序列（SD）； 在外源基因插入序列的下游區(qū)要有一個強的轉錄終止序列，保證外源基因的有效轉錄和質(zhì)粒的穩(wěn)定性。,一、質(zhì)粒(plasmid),定義：質(zhì)粒是能自主復制的雙鏈環(huán)狀DNA分子，它們在細菌中以獨立于染色體之外的方式存在。,A,OC,SC,L,F質(zhì)粒：有些攜帶有幫助其自身從一個細胞轉入另一個細胞的信息的質(zhì)粒。 R質(zhì)粒：表達對一種抗生素的抗性的質(zhì)粒。 降解質(zhì)粒：攜帶參與或控制一些不同尋常的代謝途徑的基因的質(zhì)粒。 穿梭載

9、體：在大腸桿菌的載體上放上第二個復制起始位點，使它在另一個宿主細胞中也能進行復制。,1、質(zhì)粒載體pBR322 特點 1）大小為4363bp； 2）含有兩個抗生素基因（抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素）； 3）有單一的BamH、Hind和Sal的識別位點（在四環(huán)素抗性基因內(nèi)）、Pst識別位點（在氨芐青霉素抗性基因內(nèi)）； 外源片段在BamH、 Hind、 Pst位點插入時，可引起抗生素失活來篩選重組體。 4）帶有一個復制起始點，可以保證這個質(zhì)粒只在大腸桿菌里行使復制功能，在大腸桿菌里pBR322以高拷貝數(shù)存在。,2、質(zhì)粒載體pUC19 1）特征 大小為2686bp； 帶有pBR322的復制起始位點，一個氨芐

10、青霉素抗性基因； 一個大腸桿菌乳糖操縱子半乳糖苷酶基因的調(diào)節(jié)片段（lacZ）,一個調(diào)節(jié)lacZ基因表達的阻遏蛋白的基因lacI； 含有多個單克隆位點。,2）pUC19的篩選： 培養(yǎng)基中含有異丙基硫代半乳糖苷（IPTG，lac操縱子的一個誘導物）時，lacI的產(chǎn)物就不能與lacZ的啟動子區(qū)域結合，質(zhì)粒pUC19的lacZ就可以轉錄，進而翻譯，lacZ蛋白會與染色體DNA編碼的一個蛋白形成具有活性的雜合半乳糖苷酶。 在底物5溴4氯3吲哚半乳糖苷酶（X-gal）存在下，X-gal會被雜合半乳糖苷酶水解成藍色的產(chǎn)物，沒有插入外源DNA序列的pUC19質(zhì)?？寺【统仕{色。 由于pUC19的單克隆位點的序列

11、是整合在lacZ之中的，若pUC19質(zhì)粒中插入有目的DNA片段，就會破環(huán)lacZ的結構，導致細胞無法產(chǎn)生功能性的lacZ蛋白，也就無法形成雜合的半乳糖苷酶，因而菌落是白色的。,穿梭質(zhì)粒:人工構建的具有兩種不同復制起點和選擇記號，可在兩種不同的寄主細胞中存活和復制的質(zhì)粒載體。,二、噬菌體,噬菌體可以進入裂解循環(huán)，20分鐘后就可使宿主 細胞發(fā)生裂解，同時釋放出大約100個噬菌體顆粒。,噬菌體也可以進入溶源循環(huán)，即注入的DNA整合到大腸桿菌的染色體中，以前噬菌體的形式潛伏起來，永久保留。,噬菌體DNA大約長50kb，其中大約20kb對于整合切割過程極為關鍵，稱為整合切割（I/E）區(qū)域。 對于構建文庫

12、，可將這20kbDNA片段去掉，強迫重組的噬菌體進入裂解循環(huán)。,噬菌體頭的大小足以裝下50kb單元的線性DNA， DNA52kb,則無法包裝進頭部。 cos位點（cos site）就是保證在超長線性DNA分子上每兩個cos位點之間為50kb,使DNA分子能正確的裝配進噬菌體。 在頭的入口處有一種酶，它能識別雙鏈線性DNA分子上的cos序列，并在cos序列處切斷DNA分子，使適當大小的DNA進入噬菌體的頭部。,噬菌體DNA分子示意圖,三、柯斯質(zhì)粒（cosmid） 可攜帶40kb大小的DNA片段，并在大腸桿菌中復制保存，綜合了質(zhì)粒載體和噬菌體載體二者的優(yōu)勢。 柯斯質(zhì)粒上帶有多個單克隆位點、兩個co

13、s位點、DNA復制起始位點和抗生素抗性基因，在兩個cos位點之間含有一個限制性內(nèi)切酶位點（RE）。,應用柯斯質(zhì)粒載體進行基因克隆的一般程序,利用柯斯質(zhì)?？寺〈笃蜠NA,四、YAC載體 1、目前能容納最大外源DNA片段的載體是YAC（酵母 人工染色體，yeast artificial chromosome）。 2、真核生物染色體三個關鍵部分： 著絲粒（centromere,CEN）,它主管染色體在細胞分裂過程中正確的分配到各子細胞中； 端粒（telomere,TEL）, 位于染色體的末端，對染色體末端的復制以及防止染色體被核酸外切酶切斷具有重要的意義； 自主復制序列（autonomously

14、replicating sequence,ARS）,即在染色體上的多處DNA復制起始位點。,3、作為真核基因表達載體應具備如下條件： 含有原核基因的復制起始序列（如ColE1起始序列ori）篩選標記； 含有真核基因的復制起始序列（如SV40病毒的復制序列、酵母的2質(zhì)粒的復制起始序列ARS、以及真核細胞篩選標記（如氨基糖苷G148抗性基因、在酵母細胞中與自養(yǎng)有關的基因）； 含有有效地啟動子序列（可包含增強子序列等各種順式作用元件）； RNA聚合酶所需的轉錄終止和poly(A)加入的信號序列； 合適的供外源基因插入的限制性內(nèi)切酶位點。,4、YAC 的主要功能成份有三：,1）著絲粒：mitosis姊

15、妹染色單體和減數(shù)分裂同源染色體分離之必需。 2）端粒：保護染色體末端免受核酸酶的侵襲。 3）自主復制序列（ARS）元件：是染色體自主復制的復制起點。 4）構建YAC需要4個短序列：2個端粒，著絲粒，ARS元件，選擇標記，與外源DNA連接成線性DNA分子，導入酵母細胞克隆。,pYAC4結構圖,第三節(jié) 重組基因的導入和篩選,DNA克隆的基本過程,分：分離目的基因 切：對目的基因和載體適當切割 接：目的基因與載體連接 轉：重組DNA轉入受體菌 篩：篩選出含有重組體的受菌體,基因工程技術策略,分： 基因載體 目的基因 質(zhì)粒 噬菌體 病毒 直接分離 cDNA 人工合成 基因文庫 切： 限制性內(nèi)切酶 有缺

16、口的載體 目的基因 接： 連接酶 粘端連接 平端連接 尾接法 重組體 轉： 轉化 轉染 體外包裝 帶重組體的宿主 篩： 表型篩選 電泳法 核酸雜交,基因操作的基本步驟,1、 細胞內(nèi)總DNA的提取分離,細胞內(nèi)總DNA的提取分離程序,紫外分光光度計測定DNA溶液的純度和濃度。,2、基因重組的方法：,1）根據(jù)外源DNA片段末端的性質(zhì)同載體上適當?shù)拿盖形稽c相連實現(xiàn)基因的體外重組。,外源DNA片段與載體的連接,2）當在載體的以及外源DNA片段兩端的限制酶切位點之間，不可能找到恰當?shù)钠ヅ鋾r，可采用下述方法解決： 在線狀質(zhì)粒的末端或外源DNA片段的末端用DNA連接酶接上接頭或銜接頭，這種接頭可以是含單一的或

17、多個限制性酶切位點，然后通過適當?shù)南拗泼附夂筮M行重組。,使用大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段部分補平3凹端。3凹端轉變成粘端。,5TCGA,AGCT5,xho I,5GATC,CTAG5,Sau3A I,5TCGA,AGCT5,CT,TC,5GATC,CTAG5,AG,GC,dCTP、dTTP、dATP、dGTP,Klenown酶,使用Klenow酶在4種dNTP存在下，將3凹端完全補平或用S1核酸酶、綠豆核酸酶、Klenow酶、T4DNA聚合酶去除3突出端產(chǎn)生平端DNA分子，可與任何其他平端DNA分子相連。 3）可以利用末端轉移酶分別在載體酶切位點處和外源DNA片段的3端加上相互補的

18、同聚尾同聚物加尾法，常用于雙鏈cDNA的分子克隆。,Pst1,質(zhì)粒,pG,CTGCA,ACGTC,Gp,CTGCAGGGGGG,pG,Gp,GGGGGGACGTC,AAAAAAA,mRNA,AAAAAAA,TTTTTTT,TTTTTTT,AAAAAAA,AAAAAAACCCCCC,TTTTTTT,CCCCCC,用末端轉移酶加（dG）殘基,用末端轉移酶加（dC）殘基,以oligo(dT)作引物合成cDNA第一鏈,合成cDNA第二鏈,退火,CTGCAGGGGG,AAAAAAACCCCCC G,G CCCCCC,TTTTTTTGGGGGGACGTC,轉化適當?shù)拇竽c桿菌菌株選擇抗生素抗性,轉化過程中，

19、DNA上的缺口為宿主酶所修復，從而在cDNA兩端恢復Pst1位點,Pst1,Pst1,cDNA,4）多聚酶鏈反應（PCR）為基因定向重組和構建外源基因高效表達治理提供了一個通用方法。 根據(jù)載體上的克隆位點設計PCR引物，使引物上帶有與載體克隆位點相匹配的限制性內(nèi)切酶識別序列。,3、重組DNA分子導入受體細胞,1)轉化：由于外源DNA的進入而使細胞遺傳性改變稱為轉化。采取一些方法處理細胞經(jīng)處理后的細胞就容易接受外界DNA，稱為感受態(tài)細胞：再與外源DNA接觸，就能提高轉化效率。,2)轉導：通過噬菌體或病毒的感染作用將一個細胞的遺傳信息傳遞到另一個細胞的過程用噬菌體活病毒作載體，以其DNA與目的序列

20、重組后，在體外用噬菌體或病毒的外殼蛋白將重組DNA包裝成有活力的噬菌體或病毒。就能以感染的方式進入宿主細菌或細胞，使目的序列得以復制繁殖。,3)轉染：重組的噬菌體DNA也可像質(zhì)粒DNA的方式進入宿主菌，即宿主菌先經(jīng)過CaCl2等處理成感受態(tài)細菌再接受DNA，進入感受態(tài)細菌的噬菌體DNA可以同樣復制和繁殖。這種方式稱為轉染用人工脂質(zhì)膜包裹DNA，形成的脂質(zhì)體可以通過與細胞膜融合而將DNA導入細胞。,具體方法： 氯化鈣法 電穿孔： 將宿主細胞置于一個高強電場中，通過電場脈沖在細胞壁上打孔，DNA分子隨即進入細胞。 聚乙二醇介導的原生質(zhì)體轉化法： 常用于轉化酵母以及其他真菌細胞活躍生長的細胞或菌絲體

21、用消化細胞壁的酶處理變成球形后，在適當濃度的聚乙二醇6000（PEG-6000）的介導下將外源DNA轉化入受體細胞中。,磷酸鈣或DEAE葡聚糖介導的轉染： 將外源基因?qū)氩溉轭惣毎兴矔r表達的常規(guī)方法。 磷酸鈣和DNA共沉淀：將被轉染的DNA同正在溶液中形成的磷酸鈣微粒共沉淀后可能通過內(nèi)吞作用進入受體細胞。 DEAE葡聚糖作用：可能是其與DNA結合從而抑制核酸酶的作用或與細胞結合從而促進DNA的內(nèi)吞作用。,原生質(zhì)體融合： 通過帶有多拷貝重組質(zhì)粒的細菌原生質(zhì)體同培養(yǎng)的哺乳細胞直接融合。 脂質(zhì)體法： 將DNA或RNA包裹于脂質(zhì)體內(nèi)，然后進行脂質(zhì)體與細胞膜融合將基因?qū)搿?細胞核的顯微注射法： 即將

22、目的基因重組體通過顯微注射裝置直接注入細胞核中。,4、 一般克隆基因的檢查和鑒定方法,瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定大小不等的酶解片段： 磷酸基團帶負電荷 酶解片段向陽極移動 電場驅(qū)動力和凝膠阻力 不同遷移率 分子量標準參照物,酶切和電泳方法,1）、重組質(zhì)粒的快速鑒定：根據(jù)有外源基因插入的重組質(zhì)粒同載體DNA之間大小的差異區(qū)分。 2）、重組質(zhì)粒的限制酶解分析。 3）、通過互補使菌落產(chǎn)生的顏色反應來篩選重組體。,標志補救（marker rescue） 若目的基因能夠在宿主菌表達，且表達 產(chǎn)物與宿主菌的營養(yǎng)缺陷互補，就可利用對 營養(yǎng)素的依賴表型來篩選。,宿主生長 依賴Leu 重組體 + 目的基因 能夠合成

23、Leu 在沒有Leu存在時 能生長（已轉化） 重組體轉化的細菌中 在沒有Leu存在時 不生長（沒有轉化）,4)、外源DNA片段插入失活 如果載體帶有兩個或多個抗生素抗性基因并在其上分布適宜的可供外源DNA插入的限制性內(nèi)切酶位點時，當外源DNA片段插入到一個抗性基因中去時可導致此抗性基因失活。,5)、分子雜交篩選法：,原位雜交 點雜交和southern雜交,A.核酸的分子雜交技術 在大多數(shù)核酸雜交反應中，經(jīng)過凝膠電泳分離的DNA或RNA分子，都是在雜交之前，通過毛細管作用或電導作用按其在凝膠中的位置原封不動地“吸印” 轉移到濾膜上的。 常用的濾膜有尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜，疊氮苯氧甲基纖維素濾紙

24、（DBM）和二乙氨基乙基纖維素濾膜（DEAE）,B.兩個步驟 將核酸樣品轉移到固體支持物濾膜上 核酸印跡(nucleic acid blotting)轉移 主要有電泳凝膠核酸印跡法、斑點和狹線印跡法(dot and slot blotting)、菌落和噬菌斑印跡法(colony and plaque blotting) 將具有核酸印跡的濾膜同帶有放射性標記或其它標記的DNA或RNA探針進行雜交。,（1）提取總DNA （2）酶解 （3）電泳 （4）轉移到濾膜 （5）變性解鏈 （6）DNA探針及雜交 （7）洗脫 （8）放射自顯影 （9）比較分析,Southern雜交,A. DNA體外重組實驗 B.

25、 抗生素篩選轉化子細胞 C. 培養(yǎng)突變株細胞 D. Southern雜交實驗結果顯示，外源目的基因已經(jīng)轉入突變株細胞中,Southern雜交分析示例,6)、表達文庫的免疫學篩選： 絕大多數(shù)構建噬菌體的cDNA文庫選用gt11、ZAP或ORF8作為表達載體。 這些噬菌體帶有一拷貝的大腸桿菌LacZ基因，克隆位點位于翻譯終止密碼子上游53bp處。 cDNA插入方向和閱讀框正確時，可以表達氨基端為半乳糖苷酶序列、羧基端是外源序列的融合蛋白，其中一些外源序列將暴露出可用特異抗體檢測的抗原表位。,LacZ,+,EcoRI,EcoRI,EcoRI,LacZ,gt11重組文庫,感染,在培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌落,轉膜

26、,菌落的蛋白質(zhì)裸露出來,一抗與裸露的蛋白質(zhì)結合,二抗與一抗結合,顯色,找出陽性克隆,裂解,加一抗,洗去游離的一抗，加二抗,洗去游離的二抗，加顯色劑,7)、利用PCR方法來確定基因的重組體。,克隆PCR產(chǎn)物； 通用引物：pUC/M13 primer,8)、DNA的序列分析： 這是最后確定分離的基因是否具有與天然基因相同序列的唯一方法，也是最確定的方法。,第四節(jié) 獲得真核生物目的基因的方法,鳥槍法 cDNA的方法 DNA的化學合成 利用PCR或RT-PCR分離基因 SSH與mRNADD,一、鳥槍法（shot gun）,A.染色體DNA的切斷 超聲波處理：片段長度均一，大小可控，平頭末端 全酶切：片

27、段長度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使 目的基因斷開，大小不可控 部分酶切： 片段長度可控，含有粘性末端，目的基因完整 B.與載體連接 如果轉化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載體；如果轉化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇表達型載體.,C.轉化受體細胞 如果轉化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為受體細胞；如果轉化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇能使目的基因表達的受體細胞 D.篩選含有目的基因的目的重組子 菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物功能檢測法（篩選模型的建立）,鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略,隨機克隆供體細胞的全基因組DNA片段，然

28、后通過快速有效的篩選程序從眾多克隆中分離出含有目的基因的目的重組子，進而獲得目的基因。鳥槍法適用于原核細菌目的基因的克隆分離 .,鳥槍法操作的改進,1、使用特征性限制性內(nèi)切酶切開染色體DNA 使用這一改進方法的前提條件是：目的基因的酶切圖譜已知。如果已知目的基因兩端的酶切口，可用該酶處理染色體DNA，然后與載體拼接，這樣可以保證目的基因的完整性，從而提高重組子中目的重組子的出現(xiàn)頻率 .,2、在連接前將DNA片段進行分級分離 例如，已知某目的基因位于1.8 kb的SalI片段中，將染色體DNA用SalI切開，瓊脂糖凝膠電泳分離，用刀片切下相當于1.6 - 2.0 kb大小區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，從此凝膠

29、塊中回收DNA片段，然后與載體進行拼接,鳥槍法克隆目的基因的局限性,工作量較大，需要了解目的基因的背景知識,不能獲得的最小長度的目的基因,不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結構,二、cDNA的方法 1、分離表達目的基因的組織或細胞：所用材料要盡量新鮮 2、mRNA的分離 3、第一鏈cDNA鏈的合成 4、第二條cDNA鏈的合成 5、cDNA的甲基化和接頭的加入 6、雙鏈cDNA與載體相連：插入片段：載體1：13：1 7、基因文庫的建立,1、mRNA的分離 poly(A)尾巴可以用來把mRNA同rRNA和tRNA分離開來： 1)、先提取真核細胞的總RNA； 2)、把總RNA通過一個用纖維素填充的柱子

30、； 在纖維素上結合有許多長度大約為15個核苷酸的短鏈寡聚dToligo(dT)或dT15，真核基因mRNA分子的poly(A)尾巴通過堿基配對作用與oligo(dT)結合，而其它的RNA成分因為沒有poly(A)尾巴而不能結合 3)、真核生物mRNA可以用能打斷A-T氫鍵的緩沖液洗脫下來。,2、第一鏈cDNA鏈的合成 mRNA純化以后，樣品中加入短的oligo(dT)或隨機引物分子作為引物，同時加入逆轉錄酶、緩沖液和4種脫氧核糖核苷三磷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）。 優(yōu)點：可以最大限度的減少poly(A)模板合成 cDNA的可能性； 缺點：cDNA合成總是從mRNA3端開始，在

31、最后的cDNA文庫中，代表mRNA3區(qū)域的組分所占的比例會高，而且對于一些較長的mRNA分子來說，由于反轉錄酶在cDNA合成過程中易從mRNA分子上脫開，從而造成第一條鏈合成不完整。,優(yōu)點：合成的cDNA文庫可能更好地代表最初RNA模板 所代表的組份； 缺點：由于cDNA在RNA鏈上的合成是隨機的，易產(chǎn)生較大量的非全長的RNA模板轉錄物，從而影響到全長的cDNA分子的獲得率。 因此用總體RNA和oligo(dT)引物是最有效的組合。 用逆轉錄酶在體外合成的DNA鏈往往不完整，但有一個特點：在合成停止前，DNA鏈會自己折轉回來幾個核苷酸形成一個發(fā)夾結構。,隨機引物,3、第二條cDNA鏈的合成 自

32、身引導法：利用經(jīng)一條鏈上的3端序列的折回或發(fā)卡自引導法來合成效率低，目前已不多用。 cDNA第二條鏈的置換合成法：作為第一條鏈合成反應產(chǎn)物的cDNA：mRNA雜交分子充當切口平移的模板。RNaseH在雜交分子上的mRNA鏈上造成切口，產(chǎn)生一系列的RNA引物，它們被E.coli的DNA聚合酶I用以合成第二鏈效率高，直接利用第一鏈反應產(chǎn)物，無須進一步處理和純化；省去S1酶的處理，改善了cDNA的質(zhì)量，使產(chǎn)生全長的cDNA的機率大大提高。 引物銜接頭法合成雙鏈cDNA：通過將cDNA兩端加上限制性內(nèi)切酶位點，使其較方便的克隆入相應的載體。,自身引導法,反轉錄酶,RNaseH（部分降解）,DNA聚合酶

33、,DNA聚合酶,DNA連接酶,RNA,5,5cDNA第一鏈,3,3RNA,5,5,5,5,5,5,5,5cDNA第一鏈,3cDNA第二鏈,置換合成法,4、基因文庫的建立 基因文庫：指將基因組DNA通過限制性內(nèi)切酶部分酶解后（必要時對這些DNA片段進行密度梯度離心或經(jīng)制備型凝膠電泳進行分級分離，以選擇長度適合于插入載體的片段）所產(chǎn)生的基因組DNA片段隨機地同相應的載體重組、克隆，所產(chǎn)生的克隆群體代表了基因組DNA的所有序列。,基因組DNA文庫 存在于轉化細菌內(nèi)， 由克隆載體所攜帶的所 有基因組DNA的集合。 簡稱G文庫。,cDNA文庫 用細胞總mRNA 制備全套雙鏈cDNA后， 建立的基因文庫。

34、簡稱 c文庫。,三、DNA的化學合成,1、基因片段的全化學合成 特點：首先合成組成一個基因的所有片段，相鄰的片段間有46堿基的重疊互補，在適當?shù)臈l件下經(jīng)退火后，用T4DNA連接酶將各片段以磷酸二酯鍵的共價鍵形式連接成一個完整的基因。 化學合成的DNA片段純化后其5和3端都為羥基，在組建基因前要將DNA片段的5端磷酸化（處于基因5端的兩個寡核苷酸片段不進行磷酸化，以防止基因本身在DNA重組時自身環(huán)化）。,化學合成的不足之處在于： （）要已知基因的核苷酸順序； （）基因不能太大，這一方面是測定核苷酸（或氨基酸）順序比較困難，另一方面是因為每次僅能合成幾百的短片段，短片段越多，要連接成正確的基因順序

35、就越困難，得率越低； （）價格昂貴。,基因的化學合成及克隆圖解,退火,DNA連接酶,Amp,Tet,Ampr Tett,合成的基因,2、基因的化學酶促合成 特點：不需要合成組成完整基因的所有寡核苷酸片段，而是合成其中一些片斷，相鄰的3末端有一短的序列互補，在適當?shù)臈l件下通過退火形成模板引物的復合體，然后在存在四種dNTP的條件下，用E.coli的DNA聚合酶大片段（klenow大片段）去填補互補片段之間的缺口，最后用T4DNA連接酶連接及適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切割后重組入載體。,基因的化學酶促合成圖解,退火,DNA多聚酶Iklenow片段dNTP,限制性內(nèi)切酶,分子克隆,5,5,5,5,1、PCR

36、技術的發(fā)明,PCR的發(fā)明是DNA操作技術的革命 美國Mullis教授 開汽車時的聯(lián)想,逶迤崎嶇的山路DNA雙螺旋 行駛的汽車一小段DNA引物 1988年發(fā)明了PCR技術 1993年獲得諾貝爾獎,四、利用PCR或RT-PCR分離基因,2、PCR原理 根據(jù)已知的待擴增的DNA片段序列，人工合成與該DNA兩條鏈末端互補的兩段寡核苷酸引物，在體外有模板DNA和4種脫氧核糖核苷存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促作用擴增DNA。,Mullis開車的時候, 瞬間感覺兩排路燈就是DNA的兩條鏈，自己的車和對面開來的車象是DNA聚合酶，面對面地合成著DNA， ,PCR 動畫,1st cycle,2nd cyc

37、le,3rd cycle,過 程,變 性,引 物 退 火,DNA 復制,1、反應體系具備的條件： 要有與被分離的目的基因5和3端序列互補的DNA 引物（約20個堿基左右）； 具有熱穩(wěn)定性的酶，如Taq DNA聚合酶； dNTP； 作為模板的DNA分子。,2、過程： 變性：模板DNA置于95的高溫下，使雙鏈DNA的雙鏈解開變成單鏈； 退火：將反應體系的溫度降至55左右，使得一對引物能分別與變性后的兩條模板鏈相配對； 延伸：將反應體系溫度調(diào)整到Taq DNA聚合酶作用的最適溫度72，然后以目的基因為模板，合成新的DNA鏈。,3、引物設計原則： 3末端序列不能有明顯的互補性易造成引物間二聚體，導致非

38、特異DNA片段的合成； 避免引物分子內(nèi)序列互補導致引物分子內(nèi)雙鏈區(qū)或發(fā)夾環(huán)結構的形成，引物3端形成的發(fā)夾環(huán)會引起引物內(nèi)延伸，而發(fā)生在近5端對PCR的影響不大； 注意熔點溫度。 注意引物內(nèi)穩(wěn)定性：5末端穩(wěn)定而其3末端不穩(wěn)定的引物是進行PCR合成的好引物。 當利用哺乳動物類基因組序列作為PCR模板時，對所用的引物要檢查其同Alu序列或其它短的重復序列的互補性。,4、逆轉錄PCR（retrotranscription PCR,RT-PCR）:,以RNA為模板，經(jīng)逆轉錄獲得與RNA互補的DNA鏈即cDNA,然后以cDNA鏈為模板進行的PCR反應。,帽子,AAAAA mRNA,3,5,TTTTT,以其為

39、模板進行PCR擴增,逆轉錄,合成cDNA互補鏈并退火,寡聚dT引物,優(yōu)點： 是檢測RNA分子的良好方法，也是獲取測序用模板DNA的有效手段，同時還是克隆mRNA之cDNA的重要步驟。 RT-PCR具有很高的敏感性,可以用來分析不同組織或是相同組織不同發(fā)育階段中mRNA表達狀況的相關性； 可以用來研究低表達活性基因的mRNA生理變化動態(tài)。,判斷 根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳中樣品條帶的強度比較，便能確定兩種PCR反應產(chǎn)物之間的數(shù)量關系。 前提條件 所測定的mRNA分子必須來自由一個或數(shù)個間隔子的基因。,5、錨定PCR：,特別適合預擴增那些只知道一段序列的目的DNA。 對于一端序列已知，一端序列未知的DNA

40、片段，可以通過DNA末端轉移酶給未知序列的那一端加上一段多聚dG的尾巴，然后用多聚dC和已知序列作為引物進行PCR擴增。,5,3,DNA序列,錨定引物,CCCCC（多聚dC引物）,進行PCR擴增,5,GGGGG 3,CCCCC,加多聚dG尾巴,加入引物,已知序列,擴出的未知序列,6、反向PCR,特別適合用于擴增已知序列兩端的未知序列 方法：選擇一個在已知序列中沒有，而在其兩側都存在的限制性內(nèi)切酶位點，用相應的限制性內(nèi)切酶酶解后，將酶切的片段在連接酶的作用下環(huán)化，使得已知序列位于環(huán)狀分子上，根據(jù)已知序列的兩端序列設計兩個引物，以環(huán)狀分子為模板進行PCR，就可以擴增出已知序列兩側的未知序列。,L,

41、R,酶切位點,酶切位點,L,R,已知序列,限制性內(nèi)切酶酶解,環(huán)化,RE,a,b,a,d,c,d,c,直接測序或克隆后再測序,五、SSH與mRNADD,1、 差減雜交是利用目的基因在兩種組織或細胞中表達的差異，其mRNA或單鏈cDNA進行液相雜交，除去兩者之間相同的基因成分取得。 2、 抑制消減雜交法(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)是抑制PCR和消減雜交法為基礎，在一輪反應中實現(xiàn)mRNA的均等化和消減步驟，從而有效鑒別兩個不同細胞群差異表達基因。,抑制消減雜交法最早見于1996年6月，這是一種簡便而高效的尋找差異表達基因的方法，是以抑制PCR為基礎的cDNA消減雜