1、1,組織DNA提取和純化,2,DNA的種類： 真核生物DNA 細(xì)菌DNA 病毒DNA 質(zhì)粒DNA,95%以上是雙鏈線性分子,形式多樣： 單鏈環(huán)狀 線狀 雙鏈環(huán)狀 線狀,雙鏈環(huán)狀,3,提取DNA樣品的主要來(lái)源：,生物組織 血液 培養(yǎng)細(xì)胞,4,酚-氯仿抽提法（組織DNA） 堿變性法等（質(zhì)粒DNA）；,實(shí)驗(yàn)方法,5,提取DNA的總原則： 1、保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性； 2、排除其它分子的污染。,6,其它分子的污染: (1) 對(duì)酶有抑制作用的物質(zhì),有機(jī)溶劑、高濃度金屬離子,(2)其他生物大分子(降低到最低濃度),蛋白質(zhì)、多糖和脂類,7,(3) 其它核酸的污染,提取DNA時(shí)，去除RNA 提取RNA時(shí)，去

2、除DNA,8,盡量減少抽提過(guò)程中各種影響因素對(duì)核酸的破壞；,實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)：,9,各種因素對(duì)核酸的破壞： 物理因素 化學(xué)因素 生物因素,過(guò)酸或過(guò)堿的環(huán)境,機(jī)械剪切力和高溫,各種核酸酶的降解,pH 410,EDTA等,操作輕柔 控制溫度,10,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)從生物組織中提取DNA為研究DNA的理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)功能打好基礎(chǔ)。,11,基本步驟,DNP,DNA（RNA）,紫外定量,粉碎組織,裂解液,苯酚、氯仿,RNA酶、Protase ,乙醇,純DNA,12,裂解液（Homogenization buffer）:,試劑,1%SDS,10mmol/L pH8.0 Tris-HCl,1mmol/L EDT

3、A,13,裂解細(xì)胞膜和核膜； 蛋白質(zhì)變性沉淀,1%SDS （十二烷基磺酸鈉）,是離子型表面活性劑,14,10mmol/L pH8.0 Tris-HCl,pH 57時(shí) RNA比DNA更容易游離到水相中； pH 8時(shí) DNA比RNA更容易游離到水相。,1mmol/L EDTA,抑制DNA酶活性,15,苯酚-氯仿(Phenol-Chloroform):,蛋白變性劑(有機(jī)溶劑),蛋白質(zhì),變性,酚、氯仿變性蛋白質(zhì) H20,分層,酚、氯仿,離心,DNA,16,H2O（DNA）,變性蛋白質(zhì),有機(jī)溶劑,17,酚的變性作用大于氯仿；,氯仿與水不互溶，不會(huì)帶走DNA;,使用苯酚-氯仿,酚與水有一定程度互溶，大約1

4、0-15% 的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA；,酚與氯仿是互溶的，氯仿可以帶走殘余的酚。,18,因?yàn)榉优c水有一定的互溶，苯酚用水飽和的目的是使其抽提DNA過(guò)程中不再吸收樣品中含有DNA的水分，以減少DNA 的損失。,苯酚用水飽和：,19,氯仿-異戊醇（Isoamyl-alcohol）：,異戊醇有助于分相，使離心后的分層維持穩(wěn)定。,能降低分子表面張力，所以能減少抽提過(guò)程中泡沫的產(chǎn)生。,20,冰 無(wú)水乙醇（Absolute alcohol）,低溫條件下分子運(yùn)動(dòng)大大減少，DNA易于聚合沉淀。,乙醇與核酸不會(huì)引起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)DNA很安全；,極易溶于水，乙醇會(huì)奪去DNA周圍的水分子，

5、使DNA失去水而易于聚合；,可除去殘余的氯仿。,21,70%乙醇(70% Ethonal)： 70%乙醇洗滌可去除殘余的鹽離子。,使DNA不易溶解 并可抑制酶活性,22,TE 緩沖液 （TE Buffer）： 10mmol/L pH8.0 Tris-HCl 1mmol/L EDTA,緩沖對(duì)Tris-HCl不存在金屬離子的干擾作用,抑制DNA酶的活性,23,10mg/ml蛋白酶K(Protase K)：,10mg/mlRNA酶(RNase)：,分解蛋白質(zhì)，破壞細(xì)胞膜,分解RNA,24,5mol/L NaCl：,pH為8的DNA溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaCl使Na+中和DNA

6、分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子間的同性電荷相斥力。,易于聚合而形成DNA鈉鹽沉淀,25,儀器 操作 詳見實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。,26,定量： 稀釋 吸光度測(cè)定（紫外分光光度計(jì)）： A260 = ？ A280 = ？,27,DNA純度鑒定： A260/A280 1.8, 1.6, 2.0,純,酚或蛋白質(zhì)污染,RNA污染,28,DNA濃度（g/ml） = A260nm 50 稀釋倍數(shù) 1/光徑,DNA的吸收峰在260nm,1 OD相當(dāng)于: 50 g/ml DNA 40 g/ml RNA 20 g/ml 寡核苷酸,29,DNA儲(chǔ)存：,4或-20 存放于TE緩沖液中；,30,操作中的事項(xiàng) 1.處死動(dòng)物取出所用臟器

7、后應(yīng)盡快放入液氮中,以免DNase引起DNA降解。在純化過(guò)程中要加核酸酶抑制劑(eg.EDTA),以防DNA自身降解。,2.組織要盡量研磨得細(xì)一點(diǎn)，顆粒太大細(xì)胞裂解不徹底，在隨后得保溫過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致DNA得嚴(yán)重降解。,31,3.真核細(xì)胞DNA分子量很大，機(jī)械張力極易引起DNA分子的斷裂，因此操作條件要緩和，搖動(dòng)速度不要過(guò)快，溶液轉(zhuǎn)移次數(shù)要盡量減少。,4.由于酚腐蝕性較強(qiáng)，搖動(dòng)抽提時(shí)應(yīng)戴一次性手套。,32,組織總RNA的提取和純化,(Purification and Isolation of Total RNA),33,核糖核酸（ribonucleic acid,RNA）,RNA是在細(xì)胞核中，利用

8、DNA作為模板合成的化學(xué)物質(zhì)。在蛋白質(zhì)合成中，幾種不同形式的RNA起著重要作用。,34,RNA的構(gòu)成和種類,構(gòu)成： 磷酸鹽;核糖;堿基,35,種類： messager RNA(mRNA) -攜帶DNA的編碼信息從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)中，在那兒被用于蛋白質(zhì)的合成 ribosomal RNA(rRNA) -核糖體中發(fā)現(xiàn)的一種RNA transfer RNA(tRNA) -攜帶氨基酸到核糖體中以便它們能被連接在一起合成蛋白質(zhì),36,8085% rRNA（主要是28S、18S、5S rRNA） 1015% 分子量不等的小分子RNA(tRNA、核內(nèi)小分子RNA等） 15% mRNA,37,RNA是分子生物學(xué)研

9、究的重要組成部分,cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 RNA序列分析 RT-PCR Northern Blotting 蛋白質(zhì)的體外翻譯,38,總RNA提取純化的方法和原理,常用總RNA分離方法: 酸性異硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法(acid-guanidine-phenol-chloroform, AGPC),39,異硫氰酸胍 是已知作用最強(qiáng)的蛋白變性劑，在裂解細(xì)胞釋放RNA的同時(shí)能迅速使RNA酶失活（酸性環(huán)境有利于其活性的發(fā)揮，能最大限度地發(fā)揮其對(duì)RNA酶的抑制作用）,40,十二烷基肌氨酸鈉和酚 是強(qiáng)的蛋白變性劑，對(duì)RNA酶也有一定的抑制作用。 酸性環(huán)境下RNA、蛋白質(zhì)和DNA分別進(jìn)入不同的分布相中，RNA

10、進(jìn)入上層水相，蛋白質(zhì)進(jìn)入下層有機(jī)相，DNA則進(jìn)入上下兩層界面處的中間層。,41,氯仿 不但有一定的蛋白變性作用，而且能迅速使各相分離，使RNA與其它成分分開。,DEPC配制的75%乙醇 洗滌（去除RNA表面的殘留的有機(jī)溶劑）。,42,RNA濃度（g/ml） =A260nm40 1/光徑稀釋倍數(shù) RNA得量（g） =RNA濃度最終RNA原液毫升數(shù),43,注意事項(xiàng),1. 實(shí)驗(yàn)器具預(yù)處理和配制試劑的注意點(diǎn): a.經(jīng)清洗烘干的玻璃器皿，必須在250烘烤4小時(shí)，不能經(jīng)受高溫烘烤的塑料器具，最好只用一次。 b.實(shí)驗(yàn)中要戴一次性手套。 c.RNA抽提中所用的試劑均需用DEPC處理，但含Tris的試劑除外，因DEPC遇Tris迅速分解為乙醇和CO2。,44,2. 特異性RNase抑制劑的應(yīng)用 釩酰核苷復(fù)合物（VRC） 是一種氧化釩