1、1.2 基因工程的基本操作程序,1、目的基因的獲取,2、基因表達載體的構(gòu)建,3、將目的基因?qū)胧荏w細胞,4、目的基因的檢測與鑒定,基因工程基本操作的四個步驟,一、目的基因的獲取,(一)目的基因主要是_, 也可是一些具有調(diào)控作用的因子。目的基因的獲取方法主要有_和_兩大類,編碼蛋白質(zhì)的基因,（二）獲取目的基因的常用方法有哪些?,1、從基因文庫中獲取,2、利用PCR技術(shù)擴增,3、人工合成法（反轉(zhuǎn)錄法和化學合成法）,如：與生物抗性相關(guān)的基因、與優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因、與生物藥物和保健品相關(guān)的基因、與毒物降解相關(guān)的基因、與工業(yè)用酶相關(guān)的基因等。,直接分離法,人工合成法,1、從基因文庫中獲取目的基因,（1）

2、基因文庫,將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。,種類,基因組文庫：含有一種生物的全部基因,部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因， 如：cDNA文庫,1、原核細胞基因結(jié)構(gòu)：,基因,非編碼區(qū)：,非編碼區(qū)： 調(diào)控序列,編碼區(qū)： 編碼蛋白質(zhì),終止子：終止轉(zhuǎn)錄,啟動子：啟動轉(zhuǎn)錄，RNA聚合酶結(jié)合識別位點,mRNA,翻譯,特定功能的蛋白質(zhì),轉(zhuǎn)錄,特點： 編碼區(qū)是連續(xù)的，非編碼區(qū)起調(diào)控作用,DNA分子,2：真核細胞基因結(jié)構(gòu)：,基因,非編碼區(qū)：,非編碼區(qū)：,編碼區(qū)： 編碼蛋白質(zhì),終止子,啟動子,前體mRNA,外顯子和內(nèi)含子都轉(zhuǎn)錄

3、,特點：編碼區(qū)間隔不連續(xù)！分為內(nèi)含子和外顯子。,編碼蛋白質(zhì),不編碼蛋白質(zhì),剪切掉內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄的部分,mRNA,DNA分子,提取某種生物的全部DNA,適當?shù)南拗泼?一定大小的DNA片段,將DNA片段與載體連接,重組DNA分子,基因組文庫,導入受體菌,（2）基因文庫的構(gòu)建方法,基因組文庫的構(gòu)建,有啟動子和內(nèi)含子,提取某生物特定發(fā)育時期的mRNA,單鏈DNA,雙鏈cDNA片段,重組載體,與載體連接,cDNA文庫,逆轉(zhuǎn)錄酶,DNA聚合酶,導入受體菌, cDNA文庫的構(gòu)建-逆轉(zhuǎn)錄法：,部分基因：基因的選擇性表達,無啟動子和內(nèi)含子,真核生物的基因用逆轉(zhuǎn)錄法得到的cDNA與原基因相同嗎？有哪些差異？原核生物基

4、因呢？,思考？,真核生物：無非編碼區(qū)和內(nèi)含子,原核生物：無非編碼區(qū),（3）構(gòu)建基因文庫的目的,怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因呢?,便于在不知道目的基因核苷酸序列的情況下，獲得所需的目的基因。,依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。 如：根據(jù)基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色體上的位置 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA 基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性,（4）從基因文庫中得到目的基因的方法,2、利用PCR技術(shù)擴增目的基因, 概念：PCR全稱為_，是一項 在生物_復制_的核酸合成技術(shù)。,原理：_,多聚酶鏈式反應(yīng),體外,特定DNA片段,DNA復制,前提_,一段已知目的基因的核苷酸序列,過程：,a、DNA變性（90-

5、95）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_斷裂，形成_,b、退火（復性55-65）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補的_。,氫鍵,單鏈DNA,雙鏈,DNA鏈,d.重復a.b.c步驟：每重復一次，目的基因增加_倍,一,：以_方式擴增，,指數(shù),方式：,條件：,模板DNA（含目的基因）,四種脫氧核苷酸,1對引物,熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(Taq酶),一段已知目的基因的核苷酸序列,過程：,PCR反應(yīng)體系中目的基因成指數(shù)(2n)形式擴增,蛋白質(zhì)的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的核苷酸序列,目的基因,化學合成,推測,推測,3、人工合

6、成法,基因較小，核苷酸序列已知（化學合成法）,化學法合成的目的基因含內(nèi)含子、啟動子和終止子嗎？,需要模板嗎？,反轉(zhuǎn)錄法,（1）用一定的_切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出_。 （2）用_切斷目 的基因，使其產(chǎn)生_ _。,（3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處，再加入適量_，形成了一個重組 DNA分子（重組質(zhì)粒）,限制酶,黏性末端,同一種限制酶,的黏性末端,切口,DNA連接酶,相同,1.過程:,第二步：基因表達載體的構(gòu)建,3、基因表達載體的組成？,使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代,使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用,2、基因表達載體構(gòu)建的目的？（P162）,目的基因必須在啟動子與終

7、止子之間,目的基因,啟動子：,基因的首端，RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA,終止子：,基因的尾端， 終止轉(zhuǎn)錄,標記基因：,鑒別受體細胞中是否含有目的基因,思考：作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？,不可以。因為目的基因在表達載體中得到表達并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是： （1） 生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達； （2） 通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導入受體生物中無法轉(zhuǎn)錄； （3） 目的基因是否導入受體生物中需要有

8、篩選標記； （4） 為了增強目的基因的表達水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強子等； （5） 有時需要確定目的基因表達的產(chǎn)物存在于細胞的什么部位，往往要加上可以標識存在部位的基因（或做成目的基因與標識基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。,載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標記基因和復制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu) 用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學鍵都是磷酸二酯鍵 啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少 目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去。,注意,第三步

9、：將目的基因?qū)胧荏w細胞,轉(zhuǎn)化 ,方法,將目的基因?qū)胫参锛毎?將目的基因?qū)雱游锛毎?將目的基因?qū)胛⑸锛毎?農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,基因槍法,花粉管通道法,顯微注射法,目的基因進入_內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持_和_的過程,受體細胞,穩(wěn)定,表達,Ca2+處理法,1、將目的基因?qū)胫参锛毎?（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,特點:,能感染雙子葉植物和祼子植物,對大多數(shù)單子葉植物無感染能力,Ti質(zhì)粒的TDNA可轉(zhuǎn)移至受體細胞并整合到其染色體上,轉(zhuǎn)化過程:,Ti質(zhì)粒 目的基因,構(gòu)建,基因表達載體,植物細胞,植物細胞染色體DNA上,新性狀,農(nóng)桿菌,（2）基因槍法微彈轟擊法,特點：成本高,適用于單子葉植物,（3）花粉通道法,

10、植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆?，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞。,我國轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是用這種方法獲得,2、將目的基因?qū)雱游锛毎?方法:,顯微注射技術(shù),操作程序:,提純含目的基因表達載體,取受精卵,顯微注射,早期胚胎,新性狀動物,早期胚胎培養(yǎng)技術(shù),輸卵管或子宮,胚胎移植技術(shù),受體細胞？原因？,受體細胞：受精卵 受精卵的全能性高,一定是體內(nèi)受精嗎？,不，可以體內(nèi)受精也可體外受精,3、將目的基因?qū)胛⑸锛毎?常用法：,常用菌：,微生物作受體細胞原因：,過程：,Ca2+處理大

11、腸桿菌,感受態(tài)細胞,表達載體與感受態(tài)細胞混合,感受態(tài)細胞吸收DNA,Ca2+處理法,大腸桿菌,繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少,Ca2+ 改變細胞膜的通透性，使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài),比較目的基因?qū)氩煌毎姆椒?農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,顯微注射法,Ca2+處理法,體細胞,受精卵,原核細胞,1、基因工程中科學家常用細菌、酵母菌等微生物作為受體細胞，原因是 A結(jié)構(gòu)簡單、操作方便 B繁殖速度快 C遺傳物質(zhì)含量少、簡單 D性狀穩(wěn)定、變異少 2、基因工程常用的受體細胞有 大腸桿菌 枯草桿菌 支原體 動植物細胞 A B C D,B,D,3、基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計施工的，

12、在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的步驟是 A.人工合成基因 B.目的基因與運載體結(jié)合 C.將目的基因?qū)胧荏w細胞 D.目的基因的檢測和表達,C,第四步目的基因的表達和檢測,抗蟲鑒定 抗病鑒定 活性鑒定等,抗原抗體雜交法,分子雜交法,DNA分子雜交法,（一）分子水平檢測,1、檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因，這是目的基因能否在真核生物中穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵。,DNA分子雜交技術(shù),采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。,探針：

13、用放射性同位素標記的含有目的基因的DNA片段,（二）、鑒定（個體生物學水平）,2、檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，這是檢測目的基因是否發(fā)揮功能作用的第一步。,3、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,方法:,分子雜交技術(shù),方法:,抗原抗體雜交,過程:用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA,如抗蟲棉：讓棉鈴蟲啃食棉鈴，看其是否死亡,目的基因表達成功的標志：,通過轉(zhuǎn)錄、翻譯產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白質(zhì)。,基因工程成功的標志:,生物個體表現(xiàn)出特定的性狀,練習1：(2008理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備

14、受關(guān)注。我國科學家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。 （1）獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的 處，DNA連接酶作用于 處。（填“a”或“b”）,練習1：(2008理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。 （2）將重組DNA分子導入水稻受體細胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和 法。 （3）由導入目的基因的水稻細胞培養(yǎng)成植株需要利用 技術(shù)，該技術(shù)的核心是 和 。 （4）為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標記的 作探針進行分子雜交檢測，又要用 方法從個體水平鑒定水稻

15、植株的耐鹽性。,有關(guān)基因工程的敘述正確的是 （ ） A、限制酶只在獲得目的基因時才用 B、重組質(zhì)粒的形成在細胞內(nèi)完成 C、質(zhì)粒都可作為運載體 D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料,D,有關(guān)基因工程的敘述中，錯誤的是（ ） A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來 B、 限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得 C、目的基因須由運載體導入受體細胞 D、 人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶,A,C,基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計施工的。在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的步驟是 A、人工合成目的基因 B、目的基因的檢測和表達 C、將目的基因?qū)胧荏w細胞 D、目的基因與運載體結(jié)合,（多選）人

16、們利用基因工程的方法，用大腸桿菌生產(chǎn)人類胰島素，這一過程涉及到 A.用適當?shù)拿笇σ葝u素基因與運載體進行切割并連接 B.把重組后的DNA分子導入受體細菌內(nèi)進行擴增 C.檢測重組DNA分子是否導入受體細菌內(nèi)并表達出性狀 D.篩選出能產(chǎn)生胰島素的“工程菌”,ABCD,培養(yǎng),培養(yǎng),培養(yǎng),導入,含目的基因的重組質(zhì)粒導入大腸桿菌,含有氨芐青霉素 的完全培養(yǎng)基,含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基,兩種培養(yǎng)基均不能生長大腸桿菌,Ca2+ 處理細胞形成感受態(tài)細胞,檢測,（培養(yǎng)不具有氨芐青霉素 抗性基因和四環(huán)素抗性積基因的大腸桿菌）,只有氨芐青霉素抗性基因質(zhì)粒,只具有氨芐青霉素抗性基因大腸桿菌,不具有氨芐青霉素 抗性基因和四環(huán)素抗性積基因的大腸桿菌,完全培養(yǎng)基,導入,接種培養(yǎng),接種培養(yǎng),接種培養(yǎng),含有四環(huán)素的完全培養(yǎng)基,完全培