1、植物發(fā)根培養(yǎng),導(dǎo)師：虞星炬 研究員 張 衛(wèi) 研究員 學(xué)生：曲均革,Seminar II,植物是自然界中最好的化工廠 目前超過(guò)100，000種化合物被從植物中鑒定，并以每年約4，000種新化合物的速度增加 植物次生代謝物質(zhì)大多具有生物活性，被用作醫(yī)藥品、化妝品、食品添加劑等,植物次生代謝物的獲得,直接從野生植株中分離提取 植物細(xì)胞培養(yǎng) 優(yōu)點(diǎn)：不破壞自然資源；不受季節(jié)、氣候和地域限制；不占用耕地 缺點(diǎn)：植物細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢；次生代謝物含量低；生產(chǎn)能力不穩(wěn)定；難工業(yè)化 植物發(fā)根培養(yǎng),內(nèi)容綱要,什么是發(fā)根？ 發(fā)根培養(yǎng)的特點(diǎn)、優(yōu)點(diǎn) 發(fā)展歷史 發(fā)根農(nóng)桿菌的生物學(xué)特性及致病機(jī)理 發(fā)根的誘導(dǎo)及培養(yǎng) 研究現(xiàn)狀、存在

2、問(wèn)題、解決辦法,什么是發(fā)根？,發(fā)根（hairy root）是發(fā)根農(nóng)桿菌 （Agrobacterium rhizogenes)感染整體植株或其某一器官、組織、單個(gè)細(xì)胞甚至原生質(zhì)體后，其Ri質(zhì)粒上的TDNA片斷整合進(jìn)植物細(xì)胞核基因組中誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種特殊表現(xiàn)型（形成多分枝的、生長(zhǎng)迅速的不定根）,發(fā)根培養(yǎng)的特點(diǎn)、優(yōu)點(diǎn),生長(zhǎng)迅速 激素自養(yǎng) 分化程度高 遺傳性狀穩(wěn)定 穩(wěn)定性和生長(zhǎng)迅速的特點(diǎn)是工業(yè)化生產(chǎn)夢(mèng)寐以求的，也是細(xì)胞培養(yǎng)和一般器官培養(yǎng)所不能兼?zhèn)涞?很多次生代謝產(chǎn)物僅在特定的器官或組織中形成，即只有分化才伴隨次生代謝過(guò)程的進(jìn)行，發(fā)根中含有相應(yīng)的次生代謝物含量明顯比培養(yǎng)的細(xì)胞高 近三分之一傳統(tǒng)藥材的藥用部

3、位是根，發(fā)根培養(yǎng)系統(tǒng)在傳統(tǒng)藥材生產(chǎn)中具有更重要的意義,發(fā)展歷史,1934年，Hildebrand報(bào)道了發(fā)根農(nóng)桿菌感染蘋果樹產(chǎn)生發(fā)根，自此開始對(duì)其致病機(jī)理進(jìn)行研究，并與根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）一起作為基因工程的載體 80年代后期，發(fā)根培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用在植物次生代謝物生產(chǎn)上,發(fā)根農(nóng)桿菌的生物學(xué)特性,發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes） ：土壤細(xì)菌，能侵染大多數(shù)雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物 Ri質(zhì)粒（root inducing plasmid）：TDNA區(qū)、Vir區(qū)兩個(gè)功能區(qū) TDNA區(qū)插入到寄主植物基因組中，表達(dá)決定發(fā)根生長(zhǎng)和冠癭堿合成的

4、基因，冠癭堿的檢測(cè)是評(píng)價(jià)植物轉(zhuǎn)化是否成功的證據(jù)之一 Vir區(qū)不插入寄主植物基因組DNA中，但與TDNA的轉(zhuǎn)移有關(guān)，其缺失或突變不能使感染的植物出現(xiàn)發(fā)根,Ri質(zhì)粒,Ri質(zhì)粒感染過(guò)程,發(fā)根農(nóng)桿菌感染植物傷口后，受傷的植物細(xì)胞合成特殊的小分子化合物，誘導(dǎo)Ri質(zhì)粒的Vir區(qū)基因群活化； 在Vir區(qū)基因表達(dá)產(chǎn)生的酶作用下TDNA被切下； TDNA轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞并整合到植物基因組DNA中； TDNA在細(xì)胞中轉(zhuǎn)譯，使宿主植物產(chǎn)生發(fā)根,發(fā)根的誘導(dǎo)及培養(yǎng),發(fā)根農(nóng)桿菌感染植物的方法 向植物體直接注射 對(duì)植物外植體進(jìn)行接種感染 與原生質(zhì)體共培養(yǎng) 發(fā)根的篩選及增殖培養(yǎng) 含抗生素的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)除菌 選擇生長(zhǎng)速度較快、分

5、枝較多的發(fā)根進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng) 增殖培養(yǎng)常在低鹽濃度的液體培養(yǎng)基中黑暗、恒溫條件下進(jìn)行懸浮、振蕩培養(yǎng)，適當(dāng)通入氧氣利于根的生長(zhǎng) 一般為每月增殖數(shù)十倍，最高可達(dá)上千倍（如天仙子發(fā)根每月增殖25005000倍）,發(fā)根的鑒定,形態(tài)學(xué)水平 ：激素自養(yǎng)，根叢生，多分枝， 多根毛，無(wú)向地性 組織水平：GUS活性的測(cè)定或NPTII酶的檢測(cè) 細(xì)胞水平：冠癭堿的測(cè)定 分子水平：Southern Blot方法,影響發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的因素,菌株 常用菌株：LBA9402，ATCC15834，R1601，TR105，A41027，A42659 植物及外植體 對(duì)Ri質(zhì)粒的敏感性：雙子葉植物單子葉植物，草本植物木本植物 在感染轉(zhuǎn)

6、化的受體選擇上，傾向于將葉片、子葉、子葉柄、胚軸作為外植體 將菌株、植物、外植體進(jìn)行不同的組合，會(huì)導(dǎo)致發(fā)根誘導(dǎo)率的變化 理化因子的影響 水溶性酚 ：乙酰丁香酮和羥基乙酰丁香酮、兒茶酚、原兒茶酚、沒(méi)食子酸、焦性沒(méi)食子酸、二羥基苯甲酸、香草酚和對(duì)羥基苯酚 ，激活Vir區(qū)基因表達(dá) 光照 其它 感染前高滲處理、誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)添加生長(zhǎng)素等,影響發(fā)根培養(yǎng)及次生代謝物合成的因素,培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基、碳源、氮源 植物激素 發(fā)根能在無(wú)激素培養(yǎng)基上較好生長(zhǎng)，但外源激素的加入對(duì)其生長(zhǎng)、形態(tài)和次生代謝物的合成均有影響 pH值 前體 誘導(dǎo)子 刺激代謝物的產(chǎn)生和分泌,培養(yǎng)方法 固體培養(yǎng) 液體培養(yǎng)法進(jìn)行成批培養(yǎng)或大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)

7、 兩步培養(yǎng)法 兩相培養(yǎng)法 反復(fù)成批培養(yǎng) 補(bǔ)料成批培養(yǎng) 生物反應(yīng)器 發(fā)根易受剪切力傷害，且其生長(zhǎng)迅速，密度高，供氧困難，保持低的流體壓力和高的溶氧量十分必要 通氣性能良好且剪切力較小的反應(yīng)器是其理想反應(yīng)器,影響發(fā)根培養(yǎng)及次生代謝物合成的因素,發(fā)根生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)及其培養(yǎng)系統(tǒng)的研究主要集中在： 一是盡可能減低機(jī)械剪切力對(duì)發(fā)根的損傷（減少攪拌）； 二是提高氣液傳質(zhì)速率，增加溶氧量,研究現(xiàn)狀,人參（Panax ginseng）：在無(wú)外源激素的條件下，發(fā)根生長(zhǎng)速度為用激素誘導(dǎo)根的2倍，人參皂甙（Rb和Rg）含量最高可達(dá)干重的0.95 長(zhǎng)春花（Catharanthus roseus）：從發(fā)根中檢測(cè)到細(xì)胞培養(yǎng)中一直未能得到的長(zhǎng)春堿和長(zhǎng)春新堿 親本植株能合成的次生代謝物都可用發(fā)根培養(yǎng)生產(chǎn) 發(fā)根培養(yǎng)是利用生物技術(shù)生產(chǎn)次生代謝物的新的有效途徑,存在的問(wèn)題及措施,有些植物發(fā)根難誘導(dǎo)，各轉(zhuǎn)化系統(tǒng)相對(duì)獨(dú)立，無(wú)模式系統(tǒng) 大量篩選菌種，采用合適的外植體，綜合利用各種理化因子 有些發(fā)根生長(zhǎng)不太快，有些難以維持正常的形態(tài)，常出現(xiàn)脫分化形成愈傷組織或分化出幼苗、胚狀體等現(xiàn)象，致使生產(chǎn)能力下降、培養(yǎng)失敗 采用合