1、京都念慈庵蜜煉川貝枇杷膏的限度操作方案,一、試驗材料 1、供試品：150ml/瓶 京都念慈庵蜜煉川貝枇杷膏 成份川貝母、枇杷葉、南沙參、茯苓、化橘紅、桔梗、法半夏、五味子、瓜蔞子、款冬花、遠志、苦杏仁、生姜、甘草、杏仁水、薄荷腦，輔料為：蜂蜜、麥芽糖、糖漿。 性狀本品為棕褐色稠厚的半流體；具杏仁香氣，味甜，辛涼。 功能主治 潤肺化痰、止咳平喘、護喉利咽、生津補氣、調(diào)心降火。本品適用于傷風咳嗽、痰稠、痰多氣喘、咽喉干癢及聲音嘶啞。 包裝玻璃瓶裝，每瓶裝150毫升。,2、培養(yǎng)基：培養(yǎng)基可按以下處方制備，也可使用按該處方生產(chǎn)的符合要求的脫水培養(yǎng)基。配制后，應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。 以下是本試驗

2、中要用到的培養(yǎng)基： 1)營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 2)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 3)改良馬丁培養(yǎng)基 4)玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基 5)酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（YPD） 6)膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL） 7)乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基 8)曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基（EMB） 9)8.4-甲基傘形酮葡糖苷酸（MUG） 10)三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基（TSI）,11）四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基（TTB） 12）溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基 13）亞碲硫酸鹽肉湯培養(yǎng)基 14）卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基 15）乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基 16）膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基(DHL) 17）綠膿菌素（Pyocyanin）測定用培養(yǎng)基（PDP瓊脂培養(yǎng)基） 18）梭菌增值培養(yǎng)基 1

3、9）哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基 20）4%沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基 21）1%沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基 22）沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 23）念珠菌顯色培養(yǎng)基（CHROMagar） 24）1%吐溫80-玉米瓊脂培養(yǎng)基,3、試劑： （1）試液 二鹽酸二甲基對苯二胺 取二鹽酸二甲基對苯二胺0.1g，加水10ml，即得。需新鮮少量配制，于冷處避光保存，如試液變成紅褐色，不可使用。 亞碲酸鈉（鉀）試液 取亞碲酸鈉（鉀）0.1g，加新鮮煮沸后冷至50的水10ml是溶解。 玫瑰紅鈉試液 取玫瑰紅鈉0.1g，加水使溶解成75ml。 亮綠試液 取亮綠0.1g，加水100ml使溶解。 鹽酸試液 取鹽酸8.4ml，加水使稀釋成100

4、ml。,靛基質(zhì)試液 取對二甲氨基苯甲醛5.0g，加水戊醇（或丁醇）75ml，充分振搖，使完全溶解后，在取濃鹽酸25ml徐徐滴入，邊加邊振搖，以免驟熱導致溶液色澤變深，或去對二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95ml，充分振搖，使完全溶解后，取鹽酸20ml徐徐滴入。 碘試液 取碘6g于碘化鉀5g，加水20ml使溶解。 過氧化氫試液 取濃過氧化氫溶液（30%），加水稀釋成3%的溶液。臨用時配制。 （2）試藥 十四烷酸異丙脂Isopropy Myristate 【CI7H34O2=270.46】 本品為無色液體。溶于乙醇、乙醚、丙酮、三氯甲烷或甲苯，不溶于水、甘油或丙二醇。約280分解。,二鹽酸

5、二甲基對苯二胺N，N-dimethyl-p-phenylenediaminedihydrochloride 【C8H12N22HCL=209.12】 本品為白色或灰白色結(jié)晶性粉末；指控其中色漸變暗；易吸潮。在水或乙醇中溶解。 溴化十六烷基三甲胺 Cetyl Trimethymmonium Bromide 【C19H42BrN=364.46】 本品為白色結(jié)晶。在水中溶解，在乙醇中微溶，在乙醚中不溶。 中性紅Neutral Red 【C15H17N4Cl=288.78】 本品為深綠色或棕黑色粉末。在水或乙醇中溶解。 牛肉浸出粉Beef Extracat Powder 本品為米黃色粉末，在水中溶解。

6、 牛膽鹽Ox Bile Salt 本品為淡黃色或黃棕色粉末，味苦而甜，具吸濕性。在水或 醇中易溶。,甘露醇Mannitol 【C6H14O6=182.17】 本品為白色結(jié)晶；無臭，味。在水中溶解，在乙醇中微溶。 4-甲基傘形酮葡糖苷酸 4-Methylumbelliferyl-D-glucuronide，MUG【C18H16O9=376.3】 本品為白色針狀結(jié)晶。在水、乙醇或乙醚中溶解。在喜慶氧化鈉溶液中分解。 去氧膽酸鈉Sodium Deoxycholate 【C24H39NaO4=414.56】 本品為白色結(jié)晶性粉末，味苦。易溶于水，微溶于醇，不溶于醚。 亞碲酸鈉Sodium Tellur

7、ite 【Na2TeO3=221.58】 本品為白色粉末。在熱水中易溶，在水中微溶。 玫瑰紅鈉（四氯四碘熒光素鈉）Rose Bengal Sodium Salt 【C20H2CL4I4Na2O5=1017.6】,本品為棕紅色粉末，在水中溶解，溶液中呈紫色，無熒光；在硫酸中溶解，溶液為棕色。 單硬脂酸甘油酯Glycerol Monostearte【C12H42O4=358.556】 本品為白色或黃色蠟狀。在熱有機溶劑或礦物油中溶解，在水中不溶，但與水能乳化。 枸櫞酸鈉Sodiu Citrate【C6H5Na3O72H2O】 本品為白色結(jié)晶或粉末。在水中易溶，在乙醇中不溶。 枸櫞酸鐵按Ammoni

8、um Ferric Citrate【C12H22FeN3O14=488.16】 本品為棕紅色或綠色鱗片或粉末，易潮解，見光易還原成亞鐵。在水中溶解，在醇或醚中不溶。,胰蛋白胨Tryptone 本品為米黃色粉末。在水中溶解。 硫酸鋅Zinc Sulfate【ZnSO47H2O=287.56】 本品為白色結(jié)晶、顆?；蚍勰?。在水中易溶，在甘油中溶解，在乙醇中微溶。 硫酸錳Manganese Sulfate【MnSO4H2O=169.02】 本品為粉紅色結(jié)晶。在水中溶解，在乙醇中不溶。 酪蛋白胰酶消化物（胰酪胨或酪胨）Pancreatic Digest of Casein 本品為黃色或淺黃色顆粒。以干

9、酪素為原料經(jīng)胰酶水解、活性炭脫色處理、精致而成。,（3）指示劑 中性紅指示劑 取中性紅1.0g，研細，加95%乙醇60ml使溶解，加水至100ml。 變色范圍pH6.88.0（紅黃）。 亞甲基藍指示劑 取亞甲藍0.5g，加水使溶解成100ml。 酚磺酞指示劑 取酚磺酞1.0g，加1mol/L氫氧化鈉溶液2.82ml，使溶解，再加水至100ml。 變色范圍pH6.88.4（黃紅）。 溴甲酚紫指示液 取溴甲酚紫1.6g，加95%乙醇使溶解成100ml。 變色范圍pH5.26.8（黃紫）。 曙紅鈉指示液 取曙紅鈉2.0g，加水使溶解成100ml。,4、菌種： 大腸埃希菌（Escherichia co

10、li）CMCC（B） 44 102 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B） 26 003 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CMCC（B） 63 501 白色念珠菌（Candida albicans）CMCC（F） 98 001 黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC（F） 98 003 乙型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B）CMCC（B） 50 094 銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CMCC（B） 10 104 生孢梭菌（Clostridium sporogenes）CM

11、CC（B） 64 941,二、操作方法 1、供試液的制備 供試液從制備至加入檢驗用培養(yǎng)基，不得超過1小時。 供試品40ml，取20ml加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至200ml，用勻漿儀或其他適宜的方法，混勻，作為110的供試液；取1：10的供試液10ml用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100ml，混勻，作為1：100的供試液；取1：100的供試液10ml用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100ml，混勻，作為1：1000的供試液。其余20ml供試品直接用于沙門菌的檢驗。必要時加適量的無菌聚山梨酯80，并置水浴中適當加溫使供試品分散均勻。,2、細菌、霉菌及酵母菌計數(shù) （

12、1）計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查：細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)用的培養(yǎng)基應進行培養(yǎng)基的適用性檢查。 菌液制備：接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2448小時。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50100cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)57天，加入35ml 含0.05（v/v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05（v/v）聚山梨酯80的0.

13、9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)50100cfu的孢子懸液。 菌懸液在室溫下放置應在2小時內(nèi)使用，若保存在28可在24小時內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在28，在驗證過的貯存期內(nèi)使用。,適用性檢查：取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各1ml，分別注入無菌平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置3035培養(yǎng)48小時，計數(shù)；取黑曲霉1ml，分別注入無菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置2328培養(yǎng)72小時，計數(shù)；取白色念珠菌1ml，注入無菌平皿中，立即傾注酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個平皿，混勻，

14、凝固，置2328培養(yǎng)72小時，計數(shù)。同時，用相應的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進行上述試驗。 結(jié)果判定：被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值大于70%，且菌落形態(tài)大小應與對照培養(yǎng)基上的菌落一致。判該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。,（2）計數(shù)方法的驗證 驗證時，按供試液的制備和細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)所規(guī)定的方法及下列要求進行。對各試驗菌的回收率應逐一進行驗證。 （3）菌種及菌液制備同計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查 驗證方法 驗證試驗至少應進行3次獨立的平行試驗，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。 試驗組：平皿法計數(shù)時，取試驗可能用的最低稀釋級供試液1ml和50100cfu試驗菌，分別注入

15、平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。薄膜過濾法計數(shù)時，取規(guī)定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入50100cfu試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數(shù)。 菌液組：測定所加的試驗菌數(shù)。,供試品對照組：取1ml供試液，按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)。 稀釋劑對照組：若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾等特殊處理時，應增加稀釋劑對照組，以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度。試驗時，可用相應的稀釋液替代供試品，加入試驗菌，使最終菌濃度為每1ml 供試液含50100cfu，按試驗組的供試液制備方法和菌落計數(shù)方法測定其

16、菌數(shù)。,結(jié)果判斷:在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）應均不低于70%。若試驗組的菌回收率（試驗組的平均菌落數(shù)減去供試品對照組的平均菌落數(shù)的值占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）均不低于70%，照該供試液制備方法和計數(shù)法測定供試品的細菌、霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次試驗中試驗組的菌回收率低于70%，應采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證。 若沒有適宜的方法消除供試品中的抑菌作用，那么驗證試驗中微生物回收的失敗可看成是因供試品的抗菌活性引起的，同時表明該供試品不能被

17、試驗菌污染。但是，供試品也可能僅,對試驗用菌株具有抑制作用，而對其他菌株沒有抑制作用。因此，根據(jù)供試品須符合的微生物限度標準和菌數(shù)報告規(guī)則，在不影響檢驗結(jié)果判斷的前提下，應采用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進行方法驗證試驗。若驗證試驗符合要求，應以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進行供試品檢驗。 計數(shù)方法驗證時，采用上述方法若還存在一株或多株試驗菌的回收率達不到要求，那么選擇回收情況最接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢驗。,（4）供試品檢查 計數(shù)方法包括平皿法和薄膜過濾法（本試驗采用的是平皿法）。檢查時，按已驗證的計數(shù)方法進行供試品的細菌、霉菌及酵母菌菌數(shù)的測定。 按計數(shù)方法的驗證

18、試驗確認的程序進行供試液制備。用稀釋液稀釋成110、1102、1103等稀釋級的供試液。 取供試液1ml，置直徑90mm的無菌平皿中，注入1520ml溫度不超過45的溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制備2個平板（計數(shù)時取平均值）。陰性對照試驗，取試驗用的稀釋液1ml，置無菌平皿中，注入培養(yǎng)基，凝固，倒置培養(yǎng)。每種計數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個平板，均不得有菌生長。,一般營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細菌計數(shù)；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于霉菌及酵母菌計數(shù)；酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于酵母菌計數(shù)。在特殊情況下，若營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長有霉

19、菌和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上長有細菌，則應分別點計霉菌和酵母菌、細菌菌落數(shù)。然后將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的霉菌和酵母菌數(shù)或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上的細菌數(shù)，與玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基中的霉菌和酵母菌數(shù)或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的細菌數(shù)進行比較，以菌落數(shù)高的培養(yǎng)基中的菌數(shù)為計數(shù)結(jié)果。本試驗中所用供試品含蜂蜜，應用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基測定霉菌數(shù)，用酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基測定酵母菌數(shù)，合并計數(shù)。,菌數(shù)報告規(guī)則 細菌、酵母菌宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu、霉菌宜選取平均菌落數(shù)小于100cfu的稀釋級，作為菌數(shù)報告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。以最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告1mL供試品中所含的菌數(shù)。 如各稀釋級的

20、平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均菌落數(shù)小于1時，以1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。,4、控制菌檢查 （1）控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查 控制菌檢查用的培養(yǎng)基應進行培養(yǎng)基的適用性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按培養(yǎng)基處方配制的培養(yǎng)基均應檢查。檢查項目包括培養(yǎng)基的促生長、指示和抑制特性能力。 菌種 對試驗菌種的要求同計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查。 菌液制備：接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基或改良

21、馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2448小時。用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50100cfu的菌懸液。 菌懸液在室溫下放置應在2小時內(nèi)使用，若保存在28可在24小時內(nèi)使用。,適用性檢查:控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查所用的菌株及檢測項目見表1,增菌培養(yǎng)基促生長能力檢查： 分別接種不大于100cfu的試驗菌（見表1）于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中，在相應控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)。與對照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗菌應生長良好。 固體培養(yǎng)基促生長能力檢查： 取試驗菌各0.1ml（含菌數(shù)50100cfu）分別涂布于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上，在相應控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最

22、短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)。被檢培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基生長的菌落大小形態(tài)特征應一致。 培養(yǎng)基抑制能力檢查： 接種不少于100cfu的試驗菌（見表1）于被檢培養(yǎng)基中，在相應控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最長時間下培養(yǎng)，試驗菌應不得生長。,固體培養(yǎng)基指示能力檢查： 取試驗菌各0.1ml（含菌數(shù)不大于100cfu）（見表1）分別涂布于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上，在相應控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及時間下培養(yǎng)。被檢培養(yǎng)基中試驗菌生長的菌落形態(tài)、大小、指示劑反應情況等應與對照培養(yǎng)基一致。 液體培養(yǎng)基指示能力檢查： 分別接種不大于100cfu的試驗菌（見表1）于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中，在相應控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培

23、養(yǎng)時間下培養(yǎng)。與對照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗菌生長情況、指示劑反應等應與對照培養(yǎng)基一致。,（2）控制菌檢查方法的驗證 當建立藥品的微生物限度檢查法時，應進行控制菌檢查方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該藥品的控制菌檢查。若藥品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果時，檢查方法應重新驗證。 驗證時，依各品種項下微生物限度標準中規(guī)定檢查的控制菌選擇相應驗證的菌株，驗證大腸菌群檢查法時，應采用大腸埃希菌作為驗證菌株。驗證試驗按供試液的制備和控制菌檢查法的規(guī)定及下列要求進行。 菌種及菌液制備：同控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查,驗證方法 取1ml供試液及1ml試驗菌加入增菌培養(yǎng)基中，依相應控

24、制菌檢查法進行檢查。當采用薄膜過濾法時，取1ml供試液，過濾，沖洗，試驗菌應加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入增菌培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。 結(jié)果判斷 若上述試驗檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進行供試品的該控制菌檢查；若試驗組未檢出試驗菌，應采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證。,（3）供試品檢查 供試品的控制菌檢查應按已驗證的方法進行，增菌培養(yǎng)基的實際用量同控制菌檢查方法的驗證。 陽性對照試驗：供試品進行控制菌檢查時，應做陽性對照試驗。陽性對照試驗的加菌量為1ml，方法同供試品的控制菌檢查。陽

25、性對照試驗應檢出相應的控制菌。 陰性對照試驗：取稀釋液10ml照相應控制菌檢查法檢查，作為陰性對照。陰性對照應無菌生長。,大腸埃希菌（Escherichia coli） 取供試液10ml（相當于供試品1ml），直接接種至100ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時，必要時可延長至48小時。 取上述培養(yǎng)物0.2ml，接種至含5ml MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5小時、24小時在366nm紫外線下觀察，同時用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對照。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG陽性；不呈現(xiàn)熒光，為MUG陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰

26、性。本底對照應為MUG陰性和靛基質(zhì)陰性。,如MUG陽性、靛基質(zhì)陽性，判供試品檢出大腸埃希菌；如MUG陰性、靛基質(zhì)陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌；如MUG陽性、靛基質(zhì)陰性，或MUG陰性、靛基質(zhì)陽性，則應取膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824小時。若平板上無菌落生長、或生長的菌落與表2所列的菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌。若平板上生長的菌落與表2所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，應進行分離、純化、染色鏡檢和適宜的鑒定試驗，確認是否為大腸埃希菌。,表2大腸埃希菌菌落形態(tài)特征,大腸菌群（Coliform） 取含10ml的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基

27、管3支，分別加入110的供試液1ml（含供試品0.1ml）、1100的供試液1ml（含供試品0.01ml）、11000的供試液1ml（含供試品0.001ml），另取1支乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基管加入稀釋液1ml作為陰性對照管。培養(yǎng)1824小時。 乳糖膽鹽發(fā)酵管若無菌生長、或有菌生長但不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判該管未檢出大腸菌群；若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，應將發(fā)酵管中的培養(yǎng)物分別劃線接種于曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824小時。 若平板上無菌落生長，或生長的菌落與表3所列的菌落形態(tài)特征不符或為非革蘭陰性無芽孢桿菌，判該管未檢出大腸菌群；若平板上生長的菌落與表3所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，且為革蘭陰性

28、無芽孢桿菌，應進行確證試驗。,表3大腸菌群菌落形態(tài)特征,確證試驗 從上述分離平板上挑選45個疑似菌落，分別接種于乳糖發(fā)酵管中，培養(yǎng)2448小時。若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判該乳糖膽鹽發(fā)酵管檢出大腸菌群，否則判未檢出大腸菌群。,表 4可能的大腸菌群數(shù)表,根據(jù)大腸菌群的檢出管數(shù)，按表4報告1ml供試品中的大腸菌群數(shù)。,注：+代表檢出大腸菌群；-代表未檢出大腸菌群。,沙門菌（Salmonella） 取供試品10ml，直接或處理后接種至200ml的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，用勻漿儀混勻，培養(yǎng)1824小時。 取上述培養(yǎng)物1ml，接種于10ml四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時后，分別劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱

29、瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824小時（必要時延長至4048小時）。 若平板上無菌落生長，或生長的菌落不同于表5所列的特征，判供試品未檢出沙門菌。若平板上生長的菌落與表6所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，用接種針挑選23個菌落分別于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)1824小時，如斜面未見紅色、底層未見黃色；或斜面黃色、底層無黑色，判斷供試品未檢出沙門菌。否則，應取三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面的培養(yǎng)物進行適宜的鑒定試驗，確認是否為沙門菌。,表5沙門菌菌落形態(tài)特征,銅綠假單胞菌（Peudomonas aeruginosa） 取供試液10ml（相當于供試品1ml），直接接種至100ml的膽鹽

30、乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于繡花十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824小時。 銅綠假單胞菌典型菌落呈扁平、無定形、周邊擴散、表面濕潤，灰白色，周圍時有藍綠色素擴散。如平板上無菌落生長或與上述菌落形態(tài)特征不符，判斷供試品未檢出銅綠假單胞菌。如平板生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應挑選23個菌落，分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)1824小時。取斜面培養(yǎng)物進行革蘭染色、鏡檢及氧化酶試驗。 氧化酶試驗 取潔凈濾紙片置于平皿內(nèi)，用無菌玻棒取斜面培養(yǎng)物涂于濾紙片上，滴加新配制的1%二鹽酸二甲基對苯二胺試液，在30秒內(nèi)若培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試

31、驗陽性，否則為陰性。,若斜面培養(yǎng)物為非革蘭陰性無芽孢桿菌或氧化酶試驗陰性，均判供試品未檢出銅綠假單胞菌。否則，應進行綠膿菌素試驗。 綠膿菌素(Pyocyanin)試驗 取斜面培養(yǎng)物接種于PDP瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)24小時，加氯甲烷35ml至培養(yǎng)管中，攪碎培養(yǎng)基并充分振搖。靜置片刻，將三氯甲烷相移至另一試管中，加入1mol/L鹽酸試液約1ml，振搖后，靜置片刻，觀察。若鹽酸溶液呈粉紅色，為綠膿菌素試驗陽性，否則為陰性。同時用未接種的POP瓊脂培養(yǎng)基斜面同法作陰性對照，陰性對照試驗應呈陰性。 若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗陽性及綠膿菌素試驗陽性，判供試品檢出銅綠假單胞菌。若上述疑似菌為革

32、蘭陰性桿菌、氧化酶試驗陽性及綠膿菌素試驗陰性，應繼續(xù)進行適宜的鑒定試驗，確認是否為銅綠假單胞菌。,表6金黃色葡萄菌菌落形態(tài)特征,金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 取供試液10ml（相當于供試品 1ml），直接接種至100ml的亞碲酸鈉肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時，必要時可延長至48小時。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)2472小時。若平板上無菌落生長或生長的菌落不同于表6所列特征，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。,若平板上生長的菌落與表7所列的菌落特征相符或疑似，應挑選23個菌落，分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)1

33、824小時。取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)物進行革蘭染色，并接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時，作血漿凝固酶試驗。 血漿凝固酶試驗 ：取滅菌小試管3支，各加入血漿和無菌水混合液（1：1）0.5ml，再分別加入可疑菌株的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物0.5ml、金黃色葡萄球菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)0.5ml、營養(yǎng)肉湯或0.9%無菌氯化鈉溶液0.5ml，即為試驗管、陽性對照管和陰性對照管。將3管同時培養(yǎng)，3小時后開始觀察直至24小時。陰性對照管的血漿應流動自如，陰性對照管血漿應凝固，若試驗管血漿凝固者為血漿凝固酶試驗陽性，否則為陰性。如陽性對照管或陰性對照管不符合規(guī)定時，應另制備血漿，重新試驗。 若上述疑似菌為非革蘭陽性球菌、血漿凝固酶試驗陰性，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌、,梭菌（Clostridium） 取供試液10ml（相當