1、1,第三節(jié) RNA的加工RNA Processing,2,由RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄直接產(chǎn)生的新生RNA分子被稱為初級RNA轉(zhuǎn)錄物，一般需要經(jīng)過加工才能成為有功能的成熟RNA分子。 真核細(xì)胞中，幾乎所有的初級RNA轉(zhuǎn)錄物都要經(jīng)過加工 ；原核生物 mRNA初級轉(zhuǎn)錄物無需加工就可作為翻譯的模板 。 大部分加工發(fā)生在真核細(xì)胞mRNA，以及真核和原核細(xì)胞的tRNA初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加工成熟過程中。,3,一、真核細(xì)胞mRNA由hnRNA經(jīng)轉(zhuǎn)錄后加工成為成熟分子,核不均一RNA(heterogeneous nuclear RNA, hnRNA)：真核細(xì)胞mRNA的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，也稱為mRNA前體。 hnRNA通常只包含

2、一個基因的序列，而且這些編碼多肽鏈的序列是不連續(xù)的。,4,mRNA前體的加工過程,合成5帽子結(jié)構(gòu) 由核酸內(nèi)切酶切除3 端的一段序列，代之以由poly A聚合酶催化形成的3 多聚腺苷酸(polyA)尾 通過剪接去除內(nèi)含子，拼接外顯子，形成成熟的mRNA,5,真核生物mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工修飾,外顯子 內(nèi)含子,初級轉(zhuǎn)錄物,6,（一）mRNA的5末端加帽（m7Gppp）結(jié)構(gòu),5 端形成帽子結(jié)構(gòu) (m7GpppGp-) 真核mRNA 5 末端與7-甲基鳥 嘌呤核苷以5 ，5三磷酸連接 鍵相連,7,5 端帽子結(jié)構(gòu)功能,保護(hù)mRNA使其不被核酸酶降解 與特異的帽結(jié)合蛋白質(zhì)復(fù)合體(cap-binding co

3、mplex of proteins)結(jié)合，并參與mRNA與核糖體的結(jié)合，啟動蛋白質(zhì)的生物合成,8,（二）mRNA前體在3端加poly(A)尾,9,3端poly(A)尾,形成過程需要一種包含核酸內(nèi)切酶、多聚腺苷酸聚合酶(poly(A) polymerase，PAP)和若干多亞基蛋白質(zhì)組成的多酶復(fù)合體，參與起始位點(diǎn)識別、切割和poly(A)長度控制 mRNA前體在3 端含有切割信號序列 多聚腺苷酸化的快速期有一種多聚腺苷酸結(jié)合蛋白(poly(A) binding protein ，PAB) 參與,10,（三）mRNA前體通過剪接加工除去內(nèi)含子,真核生物中的基因是不連續(xù)的,11,外顯子（exon ）

4、 ：在斷裂基因及其初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)，并表達(dá)為成熟RNA的核酸序列。 內(nèi)含子（intron） ：隔斷基因的線性表達(dá)而在剪接過程中被除去的核酸序列。 剪接(splicing)：將內(nèi)含子剪切除去，外顯子連接起來，這種mRNA前體的加工過程即為剪接。,12,剪接部位（splice site）,真核生物從酵母至哺乳動物大多數(shù)內(nèi)含子剪接部位具有共同的結(jié)構(gòu)基序：5端從GU開始，3端終止于AG 脊椎動物中內(nèi)含子5剪接部位的共有序列是AGGUAAGU，3剪接部位的共有序列是10個嘧啶(U或C)的延伸，后面緊接任意堿基，再接C，最后終止于AG,70 60 80 100 100 95 70 80 45 80 90

5、 80 100 80 80 100 100 60,G U A/G A G U C U A/G A C/U,A/C A G,N C A G G,5外顯子,5剪接位點(diǎn),分支點(diǎn),內(nèi)含子,3剪接位點(diǎn),3外顯子,嘧啶富含區(qū) （15b),20-50b,內(nèi)含子-外顯子連接部位及內(nèi)含子的特征序列,出現(xiàn)幾率 (%),hnRNA,13,mRNA前體中的內(nèi)含子是以所謂“套索”(lariat)結(jié)構(gòu)的形式被切除的,14,15,mRNA前體中的內(nèi)含子是以所謂“套索”(lariat)結(jié)構(gòu)的形式被切除的,16,真核mRNA前體剪接機(jī)制,17,(snRNPs)：小分子核糖核蛋白顆粒,18,(snRNPs)：小分子核糖核蛋白顆粒

6、,19,(snRNPs)：小分子核糖核蛋白顆粒,20,真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物選擇性加工的兩種機(jī)制,21,大鼠降鈣素基因轉(zhuǎn)錄物的選擇性加工,22,二、rRNA和tRNA加工通過核酸酶催化和修飾完成,原核rRNA前體加工： 原核細(xì)胞rRNA有三種：16S、23S和5SrRNA，這三種rRNA是一個轉(zhuǎn)錄單位，一起轉(zhuǎn)錄的，其前體是30SrRNA，中間還包含有tRNA序列 加工過程包括： 1. 特異核苷酸的甲基化 2. RNase 、RNase P和RNase E使30SrRNA前體分子斷裂，產(chǎn)生16S、23S和5S rRNA及tRNA的前體 3. 通過各種特異的核酸酶的作用，產(chǎn)生成熟的RNA,（一）真核rRN

7、A前體加工比原核復(fù)雜,23,原核rRNA前體加工,1. 標(biāo)記的位置是RNase 作用位點(diǎn) 2. 標(biāo)記的位置是RNase P作用位點(diǎn) 3. 標(biāo)記的位置是RNase E的作用位點(diǎn),24,真核rRNA前體加工： 真核細(xì)胞有4種rRNA：28S、18S、5.8S和5SrRNA。 18S、5.8S和28SrRNA的前體是45S，是一個轉(zhuǎn)錄單位，由RNA聚合酶I催化合成，而 5SrRNA是單獨(dú)的一個轉(zhuǎn)錄單位，由RNA聚合酶催化合成。 加工過程：45SrRNA前體分子的加工過程與原核生物30SrRNA前體分子的加工過程基本相同，但需要小核仁RNA(small nucleolar RNAs, snoRNAs)

8、參與，5SrRNA是單獨(dú)的一個轉(zhuǎn)錄單位， 以類似于tRNA的方式進(jìn)行加工。,25,真核rRNA前體加工,26,真核rRNA前體加工,27,（二）原核生物與真核生物tRNA前體加工基本相同,5端的16個核苷酸序列由RNase P切除 3 端的兩個尿嘧啶核苷酸由RNaseD切除，再由核苷酸轉(zhuǎn)移酶(nucleotidyltransferases)加上CCA 柄-環(huán)結(jié)構(gòu)的一些核苷酸的堿基經(jīng)化學(xué)修飾為稀有堿基 剪接切除14個核苷酸的內(nèi)含子(一般位于tRNA前體分子的反密碼子環(huán) ),28,29,三、一些內(nèi)含子RNA具有自我剪接和催 化功能,由RNA分子催化自身 內(nèi)含子剪接的反應(yīng)稱 為自我剪接(self-s

9、plicing) 自身剪接內(nèi)含子的RNA具有催化功能，是一種核酶(ribozyme),四膜蟲rRNA的剪接 采用自我剪接方式,30,組內(nèi)含子(group intron): 一類自身剪接的內(nèi)含子，以鳥嘌呤核苷或鳥嘌呤核苷酸作為輔因子，輔因子是游離的，并不是組內(nèi)含子RNA鏈的組成部分，而且也不是能量分子。 組內(nèi)含子(group intron): 另一類自身剪接的內(nèi)含子，與前面介紹的mRNA前體內(nèi)含子剪接相同，但是沒有剪接體參與。,31,32,33,四、通過轉(zhuǎn)錄后編輯一些基因可產(chǎn)生多種產(chǎn)物,有些基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸序列與基因初級轉(zhuǎn)錄物的序列并不完全對應(yīng), mRNA上的一些序列是經(jīng)過編輯(edit

10、ing)過程發(fā)生改變的。 RNA編輯最初是在某些原生細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素氧化酶的亞基基因的轉(zhuǎn)錄后加工中發(fā)現(xiàn)，通過RNA編輯在該基因的初級轉(zhuǎn)錄物中插入了4個尿嘧啶核苷酸，從而使原來的讀碼框架發(fā)生移動。,34,原生細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基基因的轉(zhuǎn)錄后編輯,(a)原生細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基基因的轉(zhuǎn)錄后編輯 (b)指導(dǎo)RNA 在RNA的編輯中的作用 (模板作用),35,apo-B基因（載脂蛋白B基因）的組織特異性表達(dá)受到RNA編輯的調(diào)節(jié),第四節(jié)RNA依賴的RNA合成RNA Dependent RNA Synthesis,36,37,以RNA作為基因組的病毒稱為RNA病毒，這類病毒除反轉(zhuǎn)錄病毒外

11、，在宿主細(xì)胞都是以病毒的單鏈RNA為模板合成RNA，這種RNA依賴的RNA合成又稱為RNA復(fù)制(RNA replication)。,轉(zhuǎn)錄,RNA復(fù)制酶,一、病毒RNA基因組通過RNA依賴的RNA聚合酶進(jìn)行復(fù)制,二、復(fù)制酶只特異識別和復(fù)制病毒RNA但缺乏校正功能,催化RNA復(fù)制的酶是RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RDRP)，也稱為RNA復(fù)制酶(RNA replicase),由病毒的RNA編碼。 RNA復(fù)制酶只能復(fù)制病毒RNA，不能以DNA為模板合成RNA。 RNA噬菌體就是以這種方式進(jìn)行RNA復(fù)制。,38,RNA復(fù)制酶的組成,大多數(shù)RNA噬菌

12、體的RNA復(fù)制酶由4個亞基組成 1個亞基(MW 65,000) 噬菌體RNA復(fù)制酶基因編碼，是復(fù)制酶的活性部位 另外3個亞基延長因子Tu、延長因子Ts和S1蛋白，都由宿主細(xì)胞自身的基因編碼，參與宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)合成?？赡茉趨f(xié)助復(fù)制酶定位和結(jié)合病毒RNA的3端的過程中起作用,39,RNA依賴的RNA合成機(jī)制和特點(diǎn),RNA依賴的RNA合成的化學(xué)反應(yīng)過程、機(jī)制與DNA依賴的RNA合成是相同的，合成的方向也是從5到3 RNA復(fù)制酶不具有校正功能,40,第五節(jié) 基因組RNA復(fù)制主要特點(diǎn)The Characteristics of Genome RNA Replication,41,一、大多數(shù)RNA病毒的基

13、因組是單鏈RNA分子,單倍體細(xì)胞或病毒中的全套染色體稱為一個基因組(Genome) 絕大多數(shù)生物的基因組是DNA，只有少數(shù)病毒基 因組是RNA 大多數(shù)RNA病毒的基因組是單鏈RNA分子，如單 鏈RNA噬菌體、脊髓灰質(zhì)炎病毒(Poliovirus)、 鼻病毒(Rhinovirus) 少數(shù)病毒的基因組是雙鏈RNA分子，如呼腸孤病 毒 (Reovirus）,42,單鏈RNA基因組分類,根據(jù)單鏈RNA基因組與其mRNA序列之間的異同 正鏈RNA (positive-strand RNA) (即與mRNA序列一致的RNA) 負(fù)鏈 RNA (negative-strand RNA) (即與mRNA序列互補(bǔ)

14、的RNA),43,RNA病毒基因組的構(gòu)成,多數(shù)RNA病毒的基因組由連續(xù)的核糖核酸鏈組成 有些病毒的基因組RNA由不連續(xù)的幾條核酸鏈組成如流感病毒，呼腸孤病毒 有的病毒自帶專門用于病毒復(fù)制的核酸酶，有的則無 有的病毒核酸并不僅有一個分子，如流感病毒有8條RNA，呼腸孤病毒有1112條雙鏈RNA,44,二、病毒基因組RNA復(fù)制需要利用宿主的翻譯系統(tǒng)合成有關(guān)酶和蛋白質(zhì),定義： 病毒基因組RNA復(fù)制是病毒在真核細(xì)胞中以自身全長的RNA分子為模板，從頭至尾合成一套新的基因組RNA。 必要條件： 1. 要有能夠特異識別并復(fù)制病毒RNA的RNA聚合酶。 2. 能利用僅能識別單順反子信息的細(xì)胞機(jī)制，從多順反子基因組（或是這些基因組的轉(zhuǎn)錄本）合成自己的蛋白。,45,策略： 1.合成多聚蛋白，然后再剪切成單個蛋白。如小型RNA 病毒。 2.合成多個亞基因組RNA，然后分別翻譯成單個蛋白。 3.將基因組分成