1、PCR-STR法親子鑒定,一、親子鑒定定義 二、原始的親子鑒定方法 三、現(xiàn)代的親子鑒定方法,一、親子鑒定的定義,親子鑒定就是利用醫(yī)學(xué)、生物學(xué)和遺傳學(xué)的理論和技術(shù)，子代和親代的形態(tài)構(gòu)造或生理機(jī)能方面的相似特點(diǎn)，分析遺傳特征，判斷父母與子女之間是否是親生關(guān)系。,二、原始的親子鑒定方法,（1）外貌對(duì)比 由于遺傳的原因，父子、母子、兄弟姐妹之間的長(zhǎng)相、膚色等一般都會(huì)有某些相似的地方，通過(guò)外貌長(zhǎng)相的對(duì)比來(lái)確定親子關(guān)系恐怕是最原始的方法，但這樣方法只是一種猜測(cè)、判斷，作為一種參考，不具有權(quán)威性。,演員姚晨 相聲演員李菁,我國(guó)演員林永健 加拿大韓裔演員吳珊卓,（2）滴骨驗(yàn)親 滴骨驗(yàn)親法就是將生者的血液滴在死

2、人的骨骸上，若血液能滲透入骨則斷定生者與死者有血源關(guān)系，否則就沒(méi)有。 三國(guó)時(shí)期的吳國(guó)人謝承所撰的會(huì)稽先賢傳就記載有以弟血滴兄骨骸之上認(rèn)領(lǐng)長(zhǎng)兄尸骨的事例；（南史豫章王綜傳也記載有以子之血滴于父骨之上驗(yàn)親的事例； 至宋代，著名法醫(yī)學(xué)家宋慈將滴骨驗(yàn)親法收入洗冤集錄中。據(jù)從現(xiàn)代的觀點(diǎn)來(lái)看，這種方法并不科學(xué)，但開創(chuàng)了用血型鑒別血源關(guān)系的先河。,（3）滴血驗(yàn)親 滴血驗(yàn)親法又稱合血驗(yàn)親法，就是將小孩的血與大人的血液放在一起，如果能融在一起，就是父母親生的，否則就不是親生的。,這種認(rèn)樣方法曾在中國(guó)宋代的法醫(yī)著作里里記載過(guò)。這種方法沒(méi)有科學(xué)依據(jù)，親子關(guān)系的血液不一定能融合，而非親子關(guān)系的血倒有可能融合,三、現(xiàn)代

3、的親子鑒定方法,（1）血型測(cè)試 血型測(cè)試進(jìn)行親子鑒定就是通過(guò)對(duì)血型的檢驗(yàn)比對(duì)來(lái)確定親子關(guān)系。依據(jù)孟德爾遺傳定律，人類的血型是按照遺傳基因傳給下一代，故一定血型的父母所生子女也具有相應(yīng)的血型。 用于血型檢驗(yàn)來(lái)鑒別親子關(guān)系的血型系統(tǒng)有：ABO 、MN 、Rh、Ss 、hp等21個(gè)血型系統(tǒng) 。 檢驗(yàn)的血型系統(tǒng)越多，其準(zhǔn)確性就越高，如果血型檢驗(yàn)的結(jié)果表示無(wú)遺傳關(guān)系，可作出否定親子關(guān)系的結(jié)論，但結(jié)果存在遺傳關(guān)系，也不能完全確定是親子關(guān)系,返回,（2）染色體多態(tài)性鑒定,染色體多態(tài)性，又稱異態(tài)性，是指正常人群中常見的各種染色體形態(tài)的微小變異（如：隨體增大、重復(fù)或缺失，著絲粒區(qū)的熒光強(qiáng)度變異等）。 這種多態(tài)是

4、可以遺傳的。這項(xiàng)技術(shù)就是利用其形態(tài)來(lái)鑒定親子關(guān)系，這要靠技術(shù)人員的主觀判斷，其準(zhǔn)確率也不盡如人意。,（3）DNA鑒定,鑒定親子關(guān)系目前用得最多的是DNA分型鑒定,包括:序列多態(tài)性和長(zhǎng)度多態(tài)性。如:人的血液、毛發(fā)、唾液、口腔細(xì)胞及骨頭等都可以用于親子鑒定，十分方便。 常用方法有DNA指紋法、SNP-PCR法、PCR-STR法等。,1.DNA指紋法 DNA指紋法的技術(shù)原理，又稱RFLP DNA指紋分析技術(shù)，將生物檢材中細(xì)胞核的DNA分離出來(lái)，用特定的限制性內(nèi)切酶消化，后經(jīng)電泳分離，Southern印跡轉(zhuǎn)移，再用已知序列小衛(wèi)星DNA探針根據(jù)堿基互補(bǔ)原則進(jìn)行雜交，用放射自顯影等技術(shù)顯示出一系列不等距離

5、，相互間隔的多條電泳譜帶組成的高度多態(tài)性圖譜，實(shí)質(zhì)為DNA的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）圖像，因各人不同（同卵雙生除外），比對(duì)結(jié)果類似指紋。,優(yōu)點(diǎn)：此技術(shù)可檢測(cè)位點(diǎn)多、特異性高、穩(wěn)定性強(qiáng)，已廣泛應(yīng)用于親子鑒定、犯人確認(rèn)、家族譜系研究，而且還擴(kuò)大應(yīng)用于疾病診斷、腫瘤以及動(dòng)物遺傳的研究中。 缺點(diǎn)：DNA指紋法操作過(guò)程繁雜、周期長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)條件高，而且不能確定每條帶的染色體定位及各位點(diǎn)之間的獨(dú)立性、在分型標(biāo)準(zhǔn)化方面也有困難。,2. PCR-SNP,指在兩條同源染色體上，同源DNA序列長(zhǎng)度相等，但個(gè)別核苷酸不同而產(chǎn)生的個(gè)體差異，也稱單核苷酸多態(tài)性（SNP）。 人類基因組中存在著廣泛的多態(tài)性，最簡(jiǎn)單的多

6、態(tài)形式是發(fā)生在基因組中的單個(gè)核苷酸的替代，即單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）。SNP通常是一種二等位基因的，即二態(tài)的遺傳變異SNP的數(shù)量大、分布廣，在組成人類基因組的30億個(gè)堿基中，平均每1000個(gè)就有一個(gè)SNP。SNP作為第三代遺傳標(biāo)記，在復(fù)雜疾病的基因定位、關(guān)聯(lián)分析、個(gè)體疾病易感性分析與藥物基因組學(xué)的研究中發(fā)揮著愈來(lái)愈重要的 作用。,3.PCR-STR法,后來(lái)又發(fā)展出一些應(yīng)用PCR的DNA分析技術(shù)的親子鑒定方法，近年來(lái)常用的是下面介紹的PCR-STR法。,PCR-STR法親子鑒定,1、 PCR-STR簡(jiǎn)介和起源 2、 PCR-ST

7、R法的原理與理論基礎(chǔ) 3、 PCR-STR法方法步驟 4、 PCR-STR 法結(jié)果分析 5、 PCR-STR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn) 6、 PCR-STR 法應(yīng)用實(shí)例 7、 PCR-STR 法應(yīng)用前景,1.PCR-STR簡(jiǎn)介和起源,（） STR STR是短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat）的簡(jiǎn)稱,又稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列SSR，或微衛(wèi)星DNA(micro-satellite)。 STR是一類廣泛存在于真核生物基因組中的DNA串聯(lián)重復(fù)序列，它由2-6 bp的核心序列組成，通常重復(fù)15-60 次，片段大小一般為100-300 bp。 STR主要由于核心序列的重復(fù)次數(shù)不同而具有高度多態(tài)性，是個(gè)體的特征

8、，遵循孟德爾共顯性遺傳規(guī)律傳遞,絕大多數(shù)不受選擇壓力的影響，且較均勻地分布人類全基因組。,（）STR的產(chǎn)生機(jī)制,微衛(wèi)星DNA重復(fù)順序的產(chǎn)生則普遍認(rèn)為是DNA復(fù)制過(guò)程中滑動(dòng)，或DNA復(fù)制和修復(fù)時(shí)滑動(dòng)鏈與互補(bǔ)鏈堿基錯(cuò)配，導(dǎo)致一個(gè)或幾個(gè)重復(fù)單位的插入或缺失。微衛(wèi)星DNA自發(fā)突變率僅104105，且核心序列越小，突變率越低。,（）STR多態(tài)性,因?yàn)镾TR具有高度的多態(tài)性，所以能廣泛應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)實(shí)踐。STR的多態(tài)性一般是指由于核心序列重復(fù)次數(shù)不同而構(gòu)成的長(zhǎng)度多態(tài)性，而長(zhǎng)度多態(tài)性檢測(cè)已被廣泛應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)個(gè)人識(shí)別和親權(quán)鑒定。,TCCCAAGCTCTTCCTCTTCCCTAGATCAATACAGACAGAAG

9、ACAGGTGGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATATCATTGAAAGACAAAACAGAGATGGATGATAGATACATGCTTACAGATGCACAC,靶區(qū)域 (short tandem repeat),7 repeats,8 repeats,9 repeats,10 repeats,11 repeats,12 repeats,13 repeats,核心串聯(lián)重復(fù)次數(shù)存在個(gè)體差異性,（4）理想的STR基因座,從實(shí)用價(jià)值考慮，用于法醫(yī)DNA分型的理想STR基因座應(yīng)具備以下特點(diǎn)： 等位基因片段長(zhǎng)度在95bp-5OObp范圍，最好在4

10、00bp以下； 具有較高的雜合度及個(gè)人識(shí)別能力，一般雜合度在0.70以上，DP0.90； 具有規(guī)律的四核苷酸或五核苷酸重復(fù)序列，陰影帶出現(xiàn)率較低，較少或沒(méi)有插入等位基因； 等位基因數(shù)為1012個(gè)，等位基因易于區(qū)分； 突變率低，不超過(guò)0.2 ； 具有高度種屬特異性。,PCR-STR起源,進(jìn)入20世紀(jì)90年代，Mullis和Saiki等學(xué)者發(fā)明并改進(jìn)的PCR 技術(shù)被用于法醫(yī)DNA 分析，從而建立了以PCR為基礎(chǔ)的第二代DNA 分型技術(shù)。 利用STR-PCR分型技術(shù)，可將人類遺傳信息數(shù)字化，根據(jù)孟德爾遺傳定律，子女的遺傳信息來(lái)源其生物學(xué)意義上的父親、母親。通過(guò)人類遺傳基因分析和現(xiàn)代化DNA檢測(cè)技術(shù)可

11、以確定父母和子女是否具有血緣關(guān)系。在親子關(guān)系的鑒定上，親子關(guān)系的概率可達(dá)到99.99%以上水平。,2. PCR-STR法的理論基礎(chǔ)與原理,理論基礎(chǔ) 人類基因組是一個(gè)結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定的體系，同時(shí)又是一個(gè)變異的體系。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，基因組DNA的序列不斷發(fā)生變異。這些變異有些被保存下來(lái)，導(dǎo)致了不同種族、群體和個(gè)體間基因組的差異和多態(tài)性。 除同卵雙生子外，沒(méi)有兩個(gè)個(gè)體基因組是完全相同的。盡管遺傳多態(tài)性的存在，但每一個(gè)人的染色體必然也只能來(lái)自其父母，這就是DNA親子鑒定的理論基礎(chǔ) 親子鑒定是根據(jù)人類遺傳學(xué)的理論和實(shí)踐，從子代和親代的形態(tài)構(gòu)造或生理機(jī)能方面的相似特點(diǎn)，分析遺傳特征，對(duì)可疑的父與子或母與子

12、之間的親生關(guān)系進(jìn)行判斷，并作出肯定或否定的結(jié)論。,原理 不同個(gè)體中，STR核心序列的重復(fù)次數(shù)不同。根據(jù)子代的兩條DNA一條來(lái)自于父方一條來(lái)自于母方，其子代某一特定DNA分子上STR核心序列重復(fù)次數(shù)必定與父母相同。 根據(jù)微衛(wèi)星DNA兩端序列的保守性，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，利用PCR技術(shù)，擴(kuò)增每個(gè)位點(diǎn)的微衛(wèi)星DNA序列，以檢測(cè)、分析微衛(wèi)星序列多態(tài)性；并確定基因排布序列及表型，最終達(dá)到成功鑒定的目的。,以上述原則為依據(jù)，美國(guó)聯(lián)邦調(diào)查局(FBI)推薦用于建設(shè)國(guó)家DNA 數(shù)據(jù)庫(kù)(combined DNA index system，C0DIS)的13個(gè)STR 基因座，作為PCRSTR 的常用檢測(cè)基因座，也成為

13、目前法醫(yī)STR分型的基礎(chǔ)位點(diǎn)。 即D3S1358、THO1、 D21S11、D18S51、 D5S818、D13S317、 D7S820、D16S539、 CSF1PO、VWA、 D8S1179、TPOX、FGA.,5 . PCR-STR法方法步驟,樣本的選擇 DNA檢測(cè)樣本很多。一般來(lái)說(shuō)，人體的任何組織或分泌物都可以做。,DNA樣品收集主要采用抽少量靜脈血或者末梢血或者收集口腔上皮細(xì)胞。此外，我們也可以進(jìn)行頭發(fā)、組織、血跡、胎兒的絨毛等特殊樣本的DNA鑒定。,方法一：DNA測(cè)序法 步驟：,材料處理 破碎細(xì)胞壁以釋放細(xì)胞內(nèi)容物破壞細(xì)胞膜使DNA釋放到提取緩沖液中DNA釋放后，盡量確保DNA的完

14、整性 分離純化 （去除雜質(zhì)包括大量的RNA、蛋白質(zhì)、多糖、單寧和色素等） SSR（Simple Sequence Repeat） 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)CMD(Cotton Marker Database)已公布的序列來(lái)設(shè)計(jì)相對(duì)SSR引物。,PCR擴(kuò)增 瓊脂糖凝膠電泳 挖膠 回收試劑盒、回收DNA片段 與特定質(zhì)粒形成重組DNA分子 導(dǎo)入大腸桿菌，篩選白斑 提取質(zhì)粒DNA DNA測(cè)序、比對(duì),PRC擴(kuò)增,比對(duì)示意圖,DNA的提取,CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）是一種陽(yáng)離子去污劑，具有從低離子強(qiáng)度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在這種條件下，蛋白質(zhì)和中性多聚糖留在溶液中。在高離子濃度下，CTAB與蛋白

15、質(zhì)和除大多數(shù)酸性多聚糖以外的多聚糖形成復(fù)合物，但不能沉淀核酸。在一定的鹽濃度下，DNA、蛋白質(zhì)與多糖在CTAB溶液中溶解度不一樣而達(dá)到去多糖的目的。 生物體內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，提取時(shí)需除去其結(jié)合的蛋白質(zhì)，然后再將DNA與RNA分開，并進(jìn)一步純化。此外需抑制 DNAase 的活性以防DNA被降解?；经h(huán)節(jié)：,方法二：Southern雜交法,步驟： 樣本的選擇 DNA的提取 PCR擴(kuò)增 瓊脂糖凝膠電泳 轉(zhuǎn)膜進(jìn)行Southern雜交（探針設(shè)計(jì)）洗膜晾干包（用保鮮膜）壓X光片（-20度-70度保存3到7天）沖洗觀察雜交圖譜（全自動(dòng)條帶分析系統(tǒng)） 注：探針設(shè)計(jì)將微衛(wèi)星DNA核心序列（CA)n串

16、聯(lián)起來(lái)，PCR擴(kuò)增（加入P32標(biāo)記的dNTP) 電泳挖膠回收試劑盒回收DNA片段導(dǎo)入載體形成重組DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌選擇白斑一部分培養(yǎng)保存，一部分提取質(zhì)粒DNA測(cè)序作為探針,6 . PCR-STR 法結(jié)果分析,電泳分離片段后，通過(guò)放射自顯影技術(shù)檢測(cè)單鏈DNA片段的放射性帶，就可以直接讀出DNA的核苷酸序列。 如果小孩的遺傳位點(diǎn)和被測(cè)試男子的位點(diǎn)超過(guò)3個(gè)不一致，那么該男子便100被排除血緣關(guān)系之外，即他絕對(duì)不可能是孩子的父親。如果孩子與其父母親的位點(diǎn)都吻合，我們就能得出親權(quán)關(guān)系大于9999的可能性，即證明他們之間的血緣親子關(guān)系。 若有12個(gè)位點(diǎn)不同，要考慮是否發(fā)生了基因突變，這是要對(duì)多個(gè)STR

17、序列位點(diǎn)進(jìn)行鑒定。,7 . STR-PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),傳統(tǒng)的血清方法能檢測(cè)紅細(xì)胞血型、白細(xì)胞血型、血清型和紅細(xì)胞酶型等，這些遺傳學(xué)標(biāo)志為蛋白質(zhì)（包括糖蛋白）或多肽，容易失活而導(dǎo)致檢材得不到理想的檢驗(yàn)結(jié)果。 此外，這些遺傳標(biāo)志均為基因編碼的產(chǎn)物，多態(tài)信息含量（PIC）有限，不能反映DNA編碼區(qū)的多態(tài)性，且這些遺傳標(biāo)志存在生理性、病理性變異（如A型、O型血的人受大腸桿菌感染后，B抗原可能呈陽(yáng)性。因此，其應(yīng)用價(jià)值有限。 DNA檢驗(yàn)可彌補(bǔ)血清學(xué)方法的不足，故受到了法醫(yī)物證學(xué)工作者的高度關(guān)注。,PCR-STR技術(shù)有如下優(yōu)點(diǎn)： 1、模板DNA片段短，擴(kuò)增效率高，靈敏度高； 2、檢材量少，僅需15ng的模板

18、DNA； 3、可使用快速的制備模板DNA； 4、擴(kuò)增結(jié)果易于分析，不需要放射性標(biāo)記； 5、可檢測(cè)部分降解或陳舊性的生物材料，尤其適于檢測(cè)血痕、精液斑、唾液、毛發(fā)、指甲、骨骼等； 6、個(gè)人識(shí)別機(jī)率和非父的排除率高。,8 . PCR-STR 法應(yīng)用實(shí)例,20 世紀(jì)90 年代，DNA 分析技術(shù)開始應(yīng)用于人類的親緣關(guān)系研究。隨著DNA 序列分析技術(shù)的日趨成熟和廣泛應(yīng)用。 利用PCR-STR進(jìn)行序列分析也逐漸應(yīng)用到家畜及野生動(dòng)物的親緣關(guān)系分析及個(gè)體識(shí)別上。,國(guó)際上關(guān)于親子鑒定和DNA身份識(shí)別的兩個(gè)最著名實(shí)例均與美國(guó)前總統(tǒng)克林頓有關(guān) A 當(dāng)矢口否認(rèn)有任何不軌行為的總統(tǒng)被要求抽取血樣以核對(duì)萊溫斯基裙子上的污

19、漬來(lái)源時(shí)，他只得承認(rèn)錯(cuò)誤以避免陷入更尷尬的境地； B 后來(lái)黑人婦女威廉斯聲稱其13歲獨(dú)生子丹尼的父親是克林頓時(shí)，克林頓毫不猶豫地抽血化驗(yàn)，最后經(jīng)DNA檢測(cè)證明威廉斯所生的黑白混血兒并非克林頓的私生子，由此足見這一技術(shù)的可靠,二、海滄野生動(dòng)物園為小斑驢采血做親子鑒定,二、海滄野生動(dòng)物園為小斑驢采血做親子鑒定,7月3日，斑馬和驢的愛(ài)情結(jié)晶國(guó)內(nèi)首只斑驢誕生海滄野生動(dòng)物園。先不說(shuō)各地媒體和游客的熱情圍觀，就是園里飼養(yǎng)員都表示：傻眼啦！原來(lái)，該園的一匹斑馬和三頭驢都散養(yǎng)在草食區(qū)里，它們?cè)趺春蒙系?，無(wú)人知曉。直到寶寶降生，這“曠世戀情”才得以曝光。不過(guò)，“男主角”是哪位，至今是謎。 廈大的科研人員為三頭公驢和小斑驢分別采集了400微升的血，進(jìn)行親子鑒定。,三、核桃親子鑒定方法的建立,目的】 針對(duì)核桃育種中父本不清、親本混淆問(wèn)題,建立簡(jiǎn)便快捷高效的核桃親本鑒定方法,也為其它林木