1、（一）立項(xiàng)依據(jù)與研究?jī)?nèi)容研究意義惡性腫瘤已成為中國(guó)城市和農(nóng)村居民的第一位死亡原因。它帶來(lái)了沉重的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。前列腺癌是歐美男性中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，在腫瘤相關(guān)的致死率中居第二位1。我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率和死亡率雖低于歐美國(guó)家，但近年來(lái)呈現(xiàn)快速上升趨勢(shì)2。多數(shù)前列腺癌患者確診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移或進(jìn)入晚期，80以上的前列腺癌晚期患者在臨床上使用雄激素阻斷治療后效果尚可，但經(jīng)歷18-24個(gè)月的緩解期后，大部分的前列腺癌最終都會(huì)進(jìn)展為轉(zhuǎn)移性去勢(shì)抵抗性前列腺癌(metastatic castration-resistant prostate cancer, mCRPC)3。高轉(zhuǎn)移率及去勢(shì)治療后的高復(fù)發(fā)率是前列

2、腺癌的重要臨床特征。轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)已成為制約前列腺癌患者長(zhǎng)期生存、提高遠(yuǎn)期療效的瓶頸，也是攻克前列腺癌的關(guān)鍵。因此，闡明前列腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找有效的預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移指標(biāo)和積極的抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移干預(yù)措施成為進(jìn)一步提高前列腺癌治療效果的關(guān)鍵。此課題將充分利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)，揭示炎癥因子與定位于亞細(xì)胞器高爾基體相關(guān)蛋白之間的相互關(guān)系，并明確這種調(diào)控關(guān)系在前列腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中的功能作用和分子機(jī)制。我們的研究成果不僅有利于揭示前列腺癌轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制，而且可能提供臨床分子靶向治療的新方法。國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀和發(fā)展動(dòng)態(tài)分析目前我國(guó)前列腺癌的病死率居高不下，臨床通常采用手術(shù)、放療、內(nèi)分泌、化療等手段治療，但對(duì)降低患者

3、的病死率仍沒(méi)有根本性突破，最重要的原因之一是前列腺癌細(xì)胞的再生復(fù)發(fā)能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力十分強(qiáng)大。因此，如果能闡明腫瘤細(xì)胞復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移機(jī)制，將對(duì)于前列腺癌的臨床治療具有十分重大的意義。已經(jīng)知道炎癥趨化因子在前列腺癌的進(jìn)展中具有重要意義，白介素-6 (Interleukin-6, IL-6)同樣參與了腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移，它可以誘導(dǎo)良性的前列腺細(xì)胞致瘤，并進(jìn)一步進(jìn)展為侵襲性的表現(xiàn)型4。IL-6在前列腺癌自然進(jìn)程中的作用引起了我們的關(guān)注。IL-6是一種具有多功能的生物活性多肽物質(zhì)，主要來(lái)源于單核巨噬細(xì)胞，部分來(lái)自于T、B淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞，某些腫瘤細(xì)胞也能產(chǎn)生IL-6。人 IL-6 基因位于

4、7號(hào)染色體，長(zhǎng)約5kb，有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，mRNA 長(zhǎng)約1.3kb。我們前期工作通過(guò)研究證實(shí)IL-6在前列腺癌中表達(dá)明顯高于增生組織和正常前列腺組織，增生組織與正常前列腺組織之間無(wú)明顯差異。激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞DU145中IL-6呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而激素依賴性前列腺癌細(xì)胞LNCaP中IL-6呈弱陽(yáng)性。晚期轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者血漿中 IL-6水平相對(duì)于早期或者健康個(gè)體的水平明顯升高。除此之外，其他研究也證實(shí)mCRPC組織中IL-6表達(dá)明顯升高，前列腺癌更容易轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)、骨等IL-6含量比較豐富的組織，IL-6表達(dá)與前列腺癌分化程度及分期密切相關(guān)5。總的來(lái)說(shuō)，升高的IL-6水平與致死性表現(xiàn)

5、型的前列腺癌相關(guān)。這表明IL-6是前列腺癌轉(zhuǎn)移直至mCRPC階段的重要因素。IL-6與mCRPC之間關(guān)系值得我們關(guān)注。CRPC形成重要原因是雄激素受體(AR)的功能異?；罨?。IL-6與體內(nèi)雄激素呈負(fù)相關(guān)，去勢(shì)后雄激素下降，IL-6升高。最新研究顯示IL-6刺激PSA及AR的mRNA使癌細(xì)胞增長(zhǎng)，可在無(wú)雄激素條件下直接刺激AR及其DNA結(jié)合區(qū)的雄激素反應(yīng)元件，使AR活性增強(qiáng)，促使癌細(xì)胞生長(zhǎng)6。IL-6是除雄激素外唯一能強(qiáng)烈刺激AR的因子?？梢?jiàn)IL-6在CRPC進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。IL-6可能通過(guò)配體非依賴方式激活A(yù)R，IL-6介導(dǎo)的AR激活是前列腺癌進(jìn)展中的重要機(jī)制。IL-6與其受體IL-6

6、R/gp130結(jié)合產(chǎn)生二聚化引發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，通過(guò)JAK/STAT信號(hào)通路，MAPK信號(hào)通路和PI3K信號(hào)通路中的各個(gè)因子，通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期，調(diào)節(jié)癌基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管的生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移等機(jī)制對(duì)腫瘤發(fā)揮作用7。為此針對(duì)IL-6這一靶點(diǎn)，有可能探索出一種有效治療前列腺癌的新途徑8。阻斷IL-6/gp130或采用IL-6單克隆抗體，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)9?？笽L-6抗體可增強(qiáng)化療藥物對(duì)前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。IL-6還可作為CRPC患者應(yīng)用受體酪氨酸激酶抑制劑耐藥標(biāo)志物10。盡管IL-6是前列腺癌轉(zhuǎn)移或CRPC進(jìn)展的促進(jìn)因子，與前列腺癌的預(yù)后有關(guān)。但考慮到IL-6介導(dǎo)CRPC轉(zhuǎn)移分

7、子機(jī)制復(fù)雜性和抗IL-6抗體應(yīng)用于臨床去勢(shì)治療患者的局限性7，仍然需要我們進(jìn)一步研究IL-6在前列腺癌中可能存在的相互調(diào)節(jié)作用及相關(guān)分子機(jī)制。 課題組前期采用組織芯片技術(shù)及功能學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高爾基磷酸化蛋白2 (Golgi phosphoprotein 2, GOLPH2)在前列腺癌轉(zhuǎn)移進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。GOLPH2又稱GOLPH2或GP73，是一種新型上皮細(xì)胞特異性跨膜蛋白，其相對(duì)分子質(zhì)量為73 000。GOLPH2編碼基因位于人第9號(hào)染色體9q21.33，長(zhǎng)約3100 bp (NM_.3)或3092bp (NM_.2)，內(nèi)含1 206 bp的開(kāi)放閱讀框，可編碼402個(gè)氨基酸。Gong等11克

8、隆一個(gè)2 599 bp的GOLPH2啟動(dòng)子片段，發(fā)現(xiàn)它可以維持上皮細(xì)胞的特異性。在正常狀態(tài)下，GOLPH2是一個(gè)完整的膜蛋白，錨定于高爾基體順面和內(nèi)側(cè)高爾基體囊泡上，主要由胞內(nèi)、跨膜和胞外區(qū)域構(gòu)成。GOLPH2 N-末端簡(jiǎn)短，是帶有1個(gè)信號(hào)肽剪切位點(diǎn)的單跨膜區(qū)，易于N-聯(lián)糖基化；C-末端編碼的氨基酸為胞外段，為一卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，內(nèi)含十四(烷)?；B續(xù)序列(GLGNGRRS)和5個(gè)糖基化位點(diǎn)，是與其它蛋白相互作用的主要功能區(qū)12,13。在疾病狀態(tài)下，GOLPH2能夠從高爾基體順面膜囊上循環(huán)出來(lái)并到達(dá)胞內(nèi)體及細(xì)胞表面14。事實(shí)上，GOLPH2是一種高爾基駐留蛋白，并不是由細(xì)胞直接分泌產(chǎn)生，可能是通過(guò)

9、位于R52VRR55位點(diǎn)的前蛋白轉(zhuǎn)化酶發(fā)生裂解，使其釋放到細(xì)胞質(zhì)中，經(jīng)過(guò)內(nèi)體運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞表面14。這說(shuō)明GOLPH2可能在蛋白運(yùn)輸中發(fā)揮作用。從GOLPH2-MAK10翻譯分泌的融合蛋白可作為一個(gè)獨(dú)特的蛋白用于非侵入性檢測(cè)15。這些為GOLPH2作為前列腺癌尿液標(biāo)志物提供了分子機(jī)制。GOLPH2作為定位于高爾基體順面的跨膜蛋白，除了具有維持著高爾基體正常形態(tài)和結(jié)構(gòu)的完整性等生理功能，最近還被認(rèn)為在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用16,17。前列腺癌細(xì)胞是上皮性質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)在基底組織膜上。這些細(xì)胞的高爾基體發(fā)達(dá)，部分細(xì)胞具有很強(qiáng)的分泌能力，例如前列腺癌細(xì)胞LNCaP可以分泌PSA、IL-6等因子。GOL

10、PH2本身是一個(gè)高爾基體膜蛋白，其結(jié)構(gòu)高度糖基化，可能與糖基化蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌相關(guān)18。GOLPH2的表達(dá)具有上皮特異性，可能是一個(gè)腫瘤上皮細(xì)胞的標(biāo)志分子，并參與腫瘤上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化19-21。我們前期研究發(fā)現(xiàn)GOLPH2在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)和分布特點(diǎn)：在激素非依賴性的前列腺癌細(xì)胞中GOLPH2的表達(dá)明顯的高于激素依賴性的前列腺癌細(xì)胞，二者之間有明顯的差異。惡性程度越高的細(xì)胞系GOLPH2的表達(dá)量也越高。GOLPH2與前列腺癌的惡性程度和激素依賴性相關(guān)。其次，我們還研究了GOLPH2在不同前列腺組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)GOLPH2在癌組織表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于增生組織和正常前列腺組織。這與先前研究報(bào)道G

11、OLPH2在前列腺癌中表達(dá)上調(diào)一致22-24，以上GOLPH2在前列腺癌細(xì)胞和組織中表達(dá)特點(diǎn)的相關(guān)研究，提示GOLPH2不僅具有診斷功能，還可能在前列腺癌自然進(jìn)程中起重要作用，并有可能作為一個(gè)預(yù)測(cè)前列腺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的生物學(xué)標(biāo)志物。我們上述研究結(jié)果已經(jīng)發(fā)表在泌尿外科專業(yè)雜志“Urology”。另有研究顯示-甲基?；?輔酶A消旋酶(AMACR)對(duì)診斷前列腺癌存在一定的假陰性率，AMACR陰性的標(biāo)本中有84% (26/31)表達(dá)GOLPH2，所以GOLPH2可能是輔助AMACR診斷前列腺癌的免疫組化標(biāo)志物23。此外前列腺癌患者尿液中和前列腺癌細(xì)胞株的培養(yǎng)上清液中都可以檢測(cè)到GOLPH2的表達(dá)21。尿

12、GOLPH2 mRNA水平與其他標(biāo)志物 (AMACR、SPINK1、PCA3和TMPRSS2:ERG)的聯(lián)合檢測(cè)前列腺癌的特異度優(yōu)于血清PSA檢查, 尿液中GOLPH2 轉(zhuǎn)錄子的表達(dá)可以作為潛在的前列腺癌標(biāo)志物24,25。GOLPH2能否成為前列腺癌預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物？這需要我們進(jìn)一步研究驗(yàn)證。如果GOLPH2能夠作為一個(gè)預(yù)測(cè)前列腺癌復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移標(biāo)志物應(yīng)用，必需要有足夠?qū)嶒?yàn)室和臨床證據(jù)證實(shí)它和前列腺癌發(fā)生或者轉(zhuǎn)移高度相關(guān)26。并且需要發(fā)現(xiàn)它在前列腺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的具體功能。除此之外，GOLPH2的表達(dá)調(diào)控機(jī)制還需要闡明，并且需要證實(shí)它的表達(dá)調(diào)控和前列腺癌轉(zhuǎn)移有關(guān)。最新研究提示GOLPH2與m

13、iRNAs (miR-27b)調(diào)控關(guān)系密切，而miRNAs參與到AR介導(dǎo)的前列腺癌轉(zhuǎn)移27-28。然而GOLPH2在前列腺癌轉(zhuǎn)移中調(diào)控機(jī)制仍不清楚。 圖1 本研究項(xiàng)目思路圖以上我們和多個(gè)實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果顯示炎癥因子IL-6和高爾基蛋白GOLPH2促進(jìn)前列腺癌轉(zhuǎn)移。但GOLPH2與IL-6兩者之間是否存在相互作用從而促進(jìn)前列腺癌轉(zhuǎn)移或mCRPC的發(fā)生尚缺乏研究。(圖1)GOLPH2與炎癥因子尤其是IL-6調(diào)控關(guān)系引起我們的注意。GOLPH2在急性肝炎、自身免疫性肝炎肝細(xì)胞中表達(dá)水平升高，由炎癥介質(zhì)調(diào)控一致。其中在肝癌細(xì)胞檢測(cè)IL-6在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平對(duì)GOLPH2表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)IL-6刺激G

14、OLPH2表達(dá)水平上調(diào)，IL-6誘導(dǎo)GOLPH2表達(dá)上調(diào)涉及IL-6受體gp130和下游轉(zhuǎn)錄因子STAT3激活29?？梢?jiàn)IL-6信號(hào)通路調(diào)控GOLPH2的表達(dá)。為了對(duì)這一調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入研究，我們前期除了對(duì)GOLPH2和IL-6在前列腺癌中表達(dá)分布特點(diǎn)做了系統(tǒng)研究，還對(duì)其在前列腺癌進(jìn)展中的功能做了初步研究。首先，RNAi沉默GOLPH2基因后，前列腺癌細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)沒(méi)有明顯改變，前列腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯減弱，提示GOLPH2在前列腺癌細(xì)胞體外增殖生物學(xué)行為中調(diào)節(jié)作用不明顯，在體外侵襲和遷移等生物學(xué)行為中起正向調(diào)節(jié)作用?？梢?jiàn)GOLPH2對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響，但其主要是在轉(zhuǎn)移中有

15、促進(jìn)作用。利用RNAi技術(shù)下調(diào)GOLPH2表達(dá)有望成為一種有效治療前列腺癌的新方法。其次我們通過(guò)檢測(cè)炎癥細(xì)胞因子IL-6在前列腺癌中的表達(dá)及其與臨床病理特性之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)IL-6是前列腺癌發(fā)生及進(jìn)展的促進(jìn)因子。 圖 2 細(xì)胞內(nèi)激酶與高爾基體蛋白相互作用影響腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移高爾基體與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和轉(zhuǎn)移高度相關(guān)，影響高爾基體與轉(zhuǎn)移關(guān)系的信號(hào)通路主要是腫瘤相關(guān)激酶通路，這類激酶包括ERK、MAPK、mTOR、Cdc42、PKD以及Rho家族蛋白(圖2) 30。它們通過(guò)對(duì)高爾基體上的某些蛋白比如GRASP65第277位絲氨酸進(jìn)行磷酸化修飾，導(dǎo)致高爾基體向細(xì)胞前緣移動(dòng)，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)移?？梢?jiàn)這些激酶也與腫瘤細(xì)胞

16、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。我們前期對(duì)GOLPH2同家族的另外一個(gè)高爾基相關(guān)蛋白GOLPH3研究發(fā)現(xiàn)：GOLPH3能通過(guò)調(diào)控EGFR和mTOR蛋白磷酸化促進(jìn)轉(zhuǎn)移。部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果已發(fā)表在腫瘤專業(yè)期刊“Journal of Cancer”。因此，GOLPH2也有可能通過(guò)這些激酶途徑調(diào)控轉(zhuǎn)移。(詳見(jiàn)工作基礎(chǔ)部分) 基于目前GOLPH2與IL-6的研究進(jìn)展和我們前期工作基礎(chǔ)，我們進(jìn)一步推測(cè)：在前列腺癌中，IL-6通過(guò)激活STAT3或者M(jìn)APK磷酸化，促進(jìn)GOLPH2的轉(zhuǎn)錄；GOLPH2的過(guò)表達(dá)激活了ERK、mTOR、Cdc42、PKD或者Rho激酶中的一條或者多條信號(hào)通路，促進(jìn)了細(xì)胞的轉(zhuǎn)移 (圖3)。此項(xiàng)課題將發(fā)現(xiàn)

17、和鑒定IL-6和GOLPH2之間的相互作用，證實(shí)特異性靶向GOLPH2在IL-6所介導(dǎo)的前列腺癌轉(zhuǎn)移中的作用和機(jī)制。同時(shí)我們將在臨床上比較GOLPH2在中國(guó)前列腺癌不同階段及正常人群尿液中的含量差異，分析GOLPH2作為預(yù)測(cè)前列腺癌進(jìn)展尿液標(biāo)志物可能性。我們的研究成果不僅有助于闡明前列腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，而且有望為臨床治療提供新的重要靶點(diǎn)，為前列腺癌新的治療策略提供理論依據(jù)。 圖3 IL-6經(jīng)GOLPH2調(diào)控轉(zhuǎn)移的可能途徑及機(jī)制參考文獻(xiàn)1. Siegel RL, Miller KD, and Jemal A. Cancer statistics, 2017. CA Cancer J Cl

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40、metastasis. Scientific World Journal, 2012: , 2012.2項(xiàng)目的研究?jī)?nèi)容、研究目標(biāo)，以及擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題（此部分為重點(diǎn)闡述內(nèi)容）；研究?jī)?nèi)容(1) 檢測(cè)IL-6及其下游信號(hào)通路對(duì)GOLPH2表達(dá)和前列腺癌細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移的影響 分別使用IL-6刺激四種前列腺癌細(xì)胞(PC-3、DU145、LNCaP、22RV1)，在四種前列腺癌細(xì)胞系中沉默IL-6，在四種前列腺癌細(xì)胞系中沉默IL-6受體gp130，熒光定量PCR和western blot檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞GOLPH2的表達(dá)，熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)雄激素下游基因的轉(zhuǎn)錄活性，transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲和

41、遷移能力。 分別使用IL-6刺激四種前列腺癌細(xì)胞(PC-3、DU145、LNCaP、22RV1)，在四種前列腺癌細(xì)胞系中沉默IL-6，在四種前列腺癌細(xì)胞系中沉默IL-6受體gp130，加入特異性藥物抑制劑SB (FHPI)，F(xiàn)R，Ruxolitinib (INCB)，WP1066，Pictilisib (GDC-0941)，Perifosine (KRX-0401)和Rapamycin (Sirolimus)抑制MAPK、ERK、JAK、STAT3、PI3K、AKT和mTOR活性，熒光定量PCR和western blot檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞GOLPH2的表達(dá)，熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)雄激素下游基因的轉(zhuǎn)

42、錄活性，transwell檢測(cè)侵襲和遷移能力。(2) 檢測(cè)GOLPH2對(duì)IL-6介導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移的影響 選擇四株高表達(dá)GOLPH2的前列腺癌細(xì)胞株(PC-3、DU145、LNCaP、22RV1)，構(gòu)建沉默GOLPH2的穩(wěn)定株和對(duì)照穩(wěn)定株。 分別對(duì)穩(wěn)定株用IL-6刺激，siRNA干擾IL-6、siRNA干擾gp130，與不處理組比較，檢測(cè)GOLPH2的表達(dá)；熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)雄激素下游基因的轉(zhuǎn)錄活性；transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移能力。 Western blot檢測(cè)MAPK、ERK、JAK、STAT3、PI3K、AKT、mTOR、Cdc42和PKD總蛋白和磷酸化蛋白變化。 熒

43、光定量PCR 檢測(cè)MMP家族基因mRNA和蛋白變化。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證特異性靶向GOLPH2抑制IL-6影響前列腺癌的轉(zhuǎn)移，構(gòu)建GOLPH2沉默和對(duì)照的前列腺癌細(xì)胞穩(wěn)定株，前列腺原位成瘤，使用IL-6刺激，應(yīng)用動(dòng)物活體成像系統(tǒng)，統(tǒng)計(jì)腫瘤轉(zhuǎn)移。(3) 尿液GOLPH2預(yù)測(cè)前列腺癌進(jìn)展的可能性收集100-200例不同階段前列腺癌以及CRPC前后病人尿液，100-200例前列腺增生病人尿液和100-200例健康人群尿液，ELISA和qRT-PCR檢測(cè)尿液中GOLPH2的含量，比較GOLPH2在前列腺癌人群、前列腺增生和健康人群中的差異，比較GOLPH2在前列腺癌病人CRPC前后的變化。用受試者工作曲線（

44、ROC）評(píng)價(jià)GOLPH2在前列腺癌中的診斷價(jià)值。研究目標(biāo)(1) 本項(xiàng)目研究目標(biāo)是通過(guò)研究炎癥因子IL-6和GOLPH2與轉(zhuǎn)移性前列腺癌的內(nèi)在關(guān)系，研究IL-6和GOLPH2相互作用影響前列腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，證實(shí)GOLPH2在IL6信號(hào)通路中具有重要作用，可能調(diào)控了其中一個(gè)或幾個(gè)信號(hào)通路的活化，闡明前列腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移分子機(jī)制，為前列腺癌新的治療策略提供理論依據(jù)。(2) 明確GOLPH2作為預(yù)測(cè)前列腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移尿液生物標(biāo)志物的可能性，證實(shí)GOLPH2在前列腺癌進(jìn)展過(guò)程中的臨床價(jià)值。擬解決關(guān)鍵問(wèn)題(1) GOLPH2在IL-6 介導(dǎo)的前列腺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中如何發(fā)揮作用？本研究在細(xì)胞和動(dòng)物個(gè)體水

45、平，通過(guò)基因沉默GOLPH2或IL-6和特異性抑制劑干預(yù)的方法，應(yīng)用相關(guān)分子生物學(xué)和小鼠動(dòng)物活體成像技術(shù)，闡明GOLPH2和IL-6調(diào)控關(guān)系以及此關(guān)系在前列腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用，揭示GOLPH2在IL-6促進(jìn)前列腺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中的分子機(jī)制。這將為臨床上通過(guò)分子靶向GOLPH2阻遏IL-6介導(dǎo)的前列腺癌轉(zhuǎn)移提供理論依據(jù)，為CRPC的治療尋求新的有效藥物并對(duì)IL-6信號(hào)傳導(dǎo)通路所進(jìn)行的腫瘤靶向治療研究提供理論基礎(chǔ)。(2) GOLPH2能否成為前列腺癌惡性程度的一個(gè)標(biāo)志物？我們通過(guò)功能學(xué)實(shí)驗(yàn)，證明GOLPH2在前列腺癌進(jìn)展過(guò)程中的發(fā)揮重要作用及可能分子機(jī)制；通過(guò)無(wú)創(chuàng)尿液檢測(cè)GOLPH2判斷前列腺

46、癌進(jìn)展和惡性程度，確認(rèn)GOLPH2作為前列腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移標(biāo)志物的價(jià)值。這將為前列腺癌診斷從血到尿的轉(zhuǎn)變，為前列腺癌的診斷和監(jiān)測(cè)更個(gè)體化提供理論支持。3擬采取的研究方案及可行性分析（包括研究方法、技術(shù)路線、實(shí)驗(yàn)手段、關(guān)鍵技術(shù)等說(shuō)明）；研究方法:(1) 第一部分：檢測(cè)IL-6及其下游信號(hào)通路對(duì)GOLPH2表達(dá)和前列腺癌細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移的影響不同濃度IL-6對(duì)前列腺癌細(xì)胞的刺激：依次設(shè)置不同濃度的IL-6(0, 0.1, 1, 10ng/ml)分別刺激四株前列腺癌細(xì)胞系(PC-3、DU145、LNCaP、22RV1) 12、24、36、48小時(shí)。分別用TRIZOL裂解液和RIPA緩沖液收集收集細(xì)胞，抽

47、提RNA和蛋白。用BIORAD iQ5熒光定量PCR儀和富士化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)分別通過(guò)qRT-PCR和western blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)和沉默之后GOLPH2 mRNA和蛋白的變化。IL-6和IL-6受體gp130的沉默：對(duì)IL-6和IL-6受體gp130各選擇四個(gè)靶點(diǎn)合成siRNA，轉(zhuǎn)染四株前列腺癌細(xì)胞(PC-3、DU145、LNCaP、22RV1)，48小時(shí)用TRIZOL裂解細(xì)胞，抽提RNA，熒光定量PCR檢測(cè)沉默效率，選擇一個(gè)干擾效率高于70%的干擾序列用于后續(xù)刺激四株前列腺癌細(xì)胞，熒光定量PCR和western blot檢測(cè)GOLPH2的表達(dá)。Transwell實(shí)驗(yàn)：先用不同濃度的IL-

48、6、IL-6和IL-6受體gp130的siRNA在6孔板中處理四株前列腺癌細(xì)胞(PC-3、DU145、LNCaP、22RV1)，然后將細(xì)胞接種至含基質(zhì)膠(侵襲)和不含基質(zhì)膠的transwell小室中，上層使用無(wú)血清培養(yǎng)基，下層使用含血清培養(yǎng)基，記錄24-48h內(nèi)穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)目，通過(guò)比較穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)目來(lái)判斷細(xì)胞的侵襲和遷移能力，分析IL-6對(duì)細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)雄激素下游基因的轉(zhuǎn)錄活性：將雄激素響應(yīng)原件克隆至PGL3-basic (firefly)載體中，與內(nèi)參質(zhì)粒(Renilla)共同轉(zhuǎn)染四株前列腺癌細(xì)胞(PC-3、DU145、LNCaP、22RV1)，24小

49、時(shí)后，加入不同濃度的IL-6或者轉(zhuǎn)染IL-6和IL-6受體gp130的siRNA，至48小時(shí)，加入細(xì)胞裂解液，裂解充分后，加入底物，檢測(cè)熒光素酶報(bào)告基因活性，分析IL-6對(duì)前列腺癌細(xì)胞雄激素下游基因轉(zhuǎn)錄的作用。IL-6下游信號(hào)通路對(duì)GOLPH2表達(dá)的影響：分別用不同濃度的IL-6、IL-6siRNA、IL-6受體gp130 siRNA刺激四種前列腺癌細(xì)胞(PC-3、DU145、LNCaP、22RV1)，之后加入特異性藥物抑制劑SB (FHPI, S1077)，F(xiàn)R(S7524)，Ruxolitinib (INCB,S1378)，WP1066 (S2796)，Pictilisib (GDC-09

50、41, S1065)，Perifosine (KRX-0401, S1037)和Rapamycin (Sirolimus,S1039)分別抑制MAPK、ERK、JAK、STAT3、PI3K、AKT和mTOR活性，熒光定量PCR和western blot檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞GOLPH2的表達(dá)，熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)雄激素下游基因的轉(zhuǎn)錄活性，transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移能力。 (2) 第二部分：檢測(cè)GOLPH2對(duì)IL-6介導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移的影響構(gòu)建沉默GOLPH2的穩(wěn)定株和對(duì)照穩(wěn)定株：根據(jù)前期熒光定量PCR和western blot的結(jié)果，選擇四株高表達(dá)GOLPH2的前列腺癌細(xì)胞系(P

51、C-3、DU145、LNCaP、22RV1)。利用慢病毒干擾載體(plenti6.3-EGFP-miR, invitrogen)構(gòu)建干擾載體用于穩(wěn)定株構(gòu)建和感染。慢病毒包裝：復(fù)蘇專用于慢病毒包裝的293T細(xì)胞，要求使用早代細(xì)胞，傳代次數(shù)在20代以內(nèi)，細(xì)胞狀態(tài)良好，無(wú)污染。復(fù)蘇后第2代接種于3.5cm皿中，過(guò)夜培養(yǎng)至細(xì)胞密度為約70%。慢病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染當(dāng)天從密度為70%的293T細(xì)胞中移除培養(yǎng)基，分別換上新鮮的1.5ml DMEM+10%FBS培養(yǎng)基(不含抗生素)，37培養(yǎng)箱放置備用。穩(wěn)定株構(gòu)建：藥物在靶細(xì)胞中篩選濃度的確定: 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中滅稻瘟素的篩選濃度一般選取為1 10 g/ml

52、。以14 天內(nèi)可殺死全部細(xì)胞的最低濃度作為篩選濃度。細(xì)胞準(zhǔn)備：狀態(tài)良好的目的細(xì)胞生長(zhǎng)至70%80%時(shí)，傳代處理，并以1000025000/孔的密度接種到24 孔板內(nèi)，使得第二天細(xì)胞密度達(dá)30% 50%左右。慢病毒感染：細(xì)胞接種24h 后換液處理，根據(jù)選取合適的慢病毒載體進(jìn)行感染。病毒感染72 h后，消化傳代，并以合適的比例接種到24孔板內(nèi)，使得第二天密度達(dá)30%50%。藥物篩選： 病毒感染的目的細(xì)胞消化傳代后第二天，開(kāi)始進(jìn)行藥物篩選，每23天更換含篩選濃度的滅稻瘟素的培養(yǎng)基一次。藥物篩選7天后，細(xì)胞傳代消化，以合適的比例接種到10cm皿，培養(yǎng)基內(nèi)加入維持濃度的滅稻瘟素(可選取為篩選濃度的1/3左右)，每34天更換篩選培養(yǎng)基一次。持續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)23周后，并進(jìn)行qRT-PCR或western blot鑒定。特異性靶向GOLPH2對(duì)IL-6介導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響：分別對(duì)穩(wěn)定株使用IL-6刺激，siRNA干擾IL-6、siRNA干擾gp130，與不處理組比較，檢測(cè)GOLPH2的表達(dá)；熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)雄激素下游基因的轉(zhuǎn)錄活性；transwell檢測(cè)遷移和侵襲。熒光定量PCR檢測(cè)MMP家族基因和細(xì)胞周期家族蛋白mRN