1、現(xiàn)代醫(yī)學(xué)儀器,第三章 第六節(jié) 血細(xì)胞分析儀 ( Blood Cell Analyzer ) 南京醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)工程處 劉堅(jiān),血細(xì)胞分析儀概述,血細(xì)胞分析儀 ( Blood Cell Analyzer ) 是指對(duì) 一定體積全血內(nèi)血細(xì)胞異質(zhì)性進(jìn)行自動(dòng)分析的 常規(guī)檢驗(yàn)儀器。 血液分析儀主要完成以下兩大功能: 血細(xì)胞計(jì)數(shù)：紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、血紅蛋白。 血細(xì)胞分類：白細(xì)胞中的 淋巴、中性、嗜酸、嗜堿、 單核、 幼稚細(xì)胞；紅細(xì)胞中的 網(wǎng)織紅細(xì)胞。 根據(jù)計(jì)數(shù)/分類的測(cè)定值計(jì)算間接測(cè)定值 紅血球容積比 (HCT)、平均紅血球血紅蛋白含量 (MCH)、 血小板容積比 (PCT)，等等,血

2、細(xì)胞分析儀概述,1947年 Coulter 發(fā)明了小孔電阻抗法 通過測(cè)量細(xì)胞的體積大小對(duì) 細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù) 主要是用來計(jì)數(shù)紅、白細(xì)胞 該技術(shù)一直被各種血液分析 儀沿用至今 1953年庫(kù)爾特家族研制出全 世界第一臺(tái)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀： Model A,Wallace H. 橫坐標(biāo)為 吸光度。 各種不同類型 的白細(xì)胞根據(jù) 其體積與吸光 度的的數(shù)值標(biāo) 記在二維坐標(biāo) 的相應(yīng)位置。,聯(lián)合型檢測(cè)法基本原理,測(cè)定原理( Principle ) 散點(diǎn)圖(Scattergram),聯(lián)合型檢測(cè)法基本原理,圖中三維坐標(biāo)分別為V、C、S，各種不同類型的白細(xì)胞 根據(jù)其VCS的值，標(biāo)記在三維坐標(biāo)的相應(yīng)位置。,白細(xì)胞三維散點(diǎn)圖,

3、測(cè)定原理( Principle ) 散點(diǎn)圖(Scattergram),（1）電阻抗(DC)、高頻傳導(dǎo)(RF)和激光散射(Scatter) 聯(lián)合檢測(cè)法：即所謂“VCS 技術(shù)”。（Coulter公司） V 代表體積(Volume)， 采用電阻抗法計(jì)數(shù)血 細(xì)胞和測(cè)量其體積； C 代表傳導(dǎo)性 (Conductivity)，主要 測(cè)量細(xì)胞內(nèi)部的結(jié)構(gòu)， 細(xì)胞內(nèi)核漿比例，質(zhì) 粒的大小和密度。,GENS System ,（1）電阻抗(DC)、高頻傳導(dǎo)(RF)和激光散射(Scatter) 聯(lián)合檢測(cè)法：即所謂“VCS 技術(shù)”。（Coulter公司） S 代表散射(Scatter)， 用于測(cè)量細(xì)胞表面不 同的結(jié)構(gòu)及

4、顆粒。 單一通道上同時(shí)用這 三種方法對(duì)同一白細(xì) 胞進(jìn)行測(cè)量，在三維 的圖像上將各細(xì)胞較 好地分開，準(zhǔn)確分類。,Total CellVolume,Coulter Principle,DirectCurrent,細(xì)胞體積,Conductivity Principle,HighFrequencyCurrent,核/漿比例,顆粒,Light Scatter Principle,Laser,細(xì)胞表面 特征,細(xì)胞體積,（2）激光散射和細(xì)胞化學(xué)染色聯(lián)合檢測(cè)法 ： ( Bayer 公司ADVIA120）、(Abx公司 Pentra120) 稀釋液中加入髓過氧化物酶 (MPO)的底物，過氧化氫和 色原可使含MP

5、O的細(xì)胞胞漿 染色。由于不同種類白細(xì)胞 含MPO不同，因此可以通過 染色的深淺加以區(qū)別。 加入特殊溶血?jiǎng)┦沟贸葔A 細(xì)胞以外的細(xì)胞全部裸核化。,ADVIA 120,（2）激光散射和細(xì)胞化學(xué)染色聯(lián)合檢測(cè)法 ： ( Bayer 公司ADVIA120）、(Abx公司 Pentra120) 用兩個(gè)流式通道進(jìn)行測(cè)定， 髓過氧化物酶通道( 鹵素?zé)?光源，測(cè)吸光度與散射光)； 嗜堿性核葉通道（激光光 源，測(cè)高角度散射光與低角 度散射光)。通道還同時(shí)進(jìn)行 紅細(xì)胞、血小板及網(wǎng)織紅細(xì) 胞的測(cè)定。,Pentra 120,（3）多角度激光偏振光散射檢測(cè)電阻抗聯(lián)合檢測(cè)法： （Abbott 公司CD-3500） 完全用激

6、光散射方 法進(jìn)行白細(xì)胞分類， 其測(cè)散射光所用的 角度為四個(gè)。即 0o、 10o、90o 和90o 消偏 振 (depolarized) 。 電阻抗法用于計(jì) 數(shù)白細(xì)胞總數(shù)。,CELL-DYN 3500,（3）多角度激光偏振光散射檢測(cè)電阻抗聯(lián)合檢測(cè)法： （Abbott 公司CD-3500） 完全用激光散射方 法進(jìn)行白細(xì)胞分類， 其測(cè)散射光所用的 角度為四個(gè)。即 0o、 10o、90o 和90o 消偏 振 (depolarized) 。 電阻抗法用于計(jì) 數(shù)白細(xì)胞總數(shù)。,CELL-DYN 3500,（4）電阻抗和射頻傳導(dǎo)聯(lián)合檢測(cè)特殊溶血?jiǎng)┓ǎ?（Sysmex公司 NE-8000、SE-9000 ） 淋

7、巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞檢測(cè)通道(DC+RF) 嗜堿性細(xì)胞檢測(cè)通道 （特殊溶血?jiǎng)?） 嗜酸性細(xì)胞檢測(cè)通道 （特殊溶血?jiǎng)?） 幼稚細(xì)胞檢測(cè) 通道(硫化氨基酸),SE-9000,計(jì)數(shù)網(wǎng)織紅細(xì)胞的方法： 在紅細(xì)胞稀釋液中加入可染RNA的熒光染料， 經(jīng)激光激發(fā)后在檢測(cè)器中加以計(jì)數(shù)。 各公司生產(chǎn)的儀器計(jì)數(shù)網(wǎng)織紅細(xì)胞時(shí)基本都 采用這種方法。 多數(shù)儀器中網(wǎng)織紅細(xì)胞的測(cè)定使用單獨(dú)的激 光檢測(cè)通道，不少儀器生產(chǎn)廠家將此功能做 成獨(dú)立儀器或選購(gòu)件供用戶選擇。,血細(xì)胞分析儀 檢測(cè)流程,血細(xì)胞分析儀工作流程圖,維護(hù)工作的基本要點(diǎn) 電路系統(tǒng)（儀器供電電壓、各種傳感器狀態(tài)） 流體系統(tǒng)（各種管道、電磁閥、正負(fù)壓力） 機(jī)

8、械運(yùn)動(dòng)（加樣針、注射器、旋轉(zhuǎn)閥） 比色通道（光源燈、濾光片） 維修軟件（各點(diǎn)電壓檢測(cè)、運(yùn)動(dòng)部件檢測(cè)） 基本要點(diǎn)可能因?yàn)楦鞣N儀器的型號(hào)不同而不盡 適用，可依據(jù)具體情況來分別對(duì)待，但經(jīng)過仔細(xì)觀 察和深入了解一定可以掌握對(duì)自己使用的機(jī)型的基 本維護(hù)。,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)儀器,第三章 第七節(jié) 流式細(xì)胞分析儀 （Flow cytometer） 南京醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)工程處 劉堅(jiān),流式細(xì)胞分析儀概述,流式細(xì)胞分析儀（flow cytometer）是集計(jì)算機(jī)技術(shù)、 電子物理技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)、激光技術(shù)、流體力學(xué)技 術(shù)、細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)于一體的高科技細(xì) 胞分析儀。 流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cyt

9、ometry) 是利用流式細(xì)胞儀對(duì)處 于快速流動(dòng)的細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速（每秒 可達(dá)1000-10000個(gè)）的定量分析和分選（純度可達(dá)99% 以上）的技術(shù)。 流式細(xì)胞儀在細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)、 病理學(xué)、遺傳學(xué)、臨床檢驗(yàn)等學(xué)科中得到廣泛應(yīng)用。,流式細(xì)胞儀基本原理,待測(cè)標(biāo)本制備成單細(xì)胞懸液通過熒光染色后加 壓進(jìn)入充滿鞘液的流動(dòng)室。 鞘液壓力與樣品流壓力差異達(dá)到一定比例時(shí)， 鞘液包裹著樣品流中細(xì)胞排成單列逐個(gè)經(jīng)過激 光聚焦區(qū)。 通過激光檢測(cè)區(qū)的細(xì)胞受激光照射，產(chǎn)生散射 光；部分被標(biāo)上特異性熒光染料的細(xì)胞，產(chǎn)生 特定波長(zhǎng)的熒光。,流式細(xì)胞儀基本原理,通過一定波長(zhǎng)選擇通透性的濾光片

10、，將散射光、 不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)區(qū)分開來，并送到不同的 光電檢測(cè)通道。 經(jīng)過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)換、放大，數(shù)字化處理，就 可以在計(jì)算機(jī)上直觀的得到染上各種熒光染料 的細(xì)胞各自的百分率。 細(xì)胞分選功能可以將具有某種特征的細(xì)胞分選 出來，以便進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。,流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu),(一）流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng) （二）激光光源及光束形成系統(tǒng) （三）光學(xué)系統(tǒng)：透鏡,濾光片,小孔,聚焦光源， 收集不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào) (四）信號(hào)檢測(cè)與存儲(chǔ)、顯示、分析系統(tǒng)：光電倍 增管（PMT）、補(bǔ)償電路。熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為 電信號(hào)，并將信號(hào)放大 （五）細(xì)胞分選系統(tǒng),FCM基本結(jié)構(gòu)圖解,流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu),流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng),流動(dòng)室與

11、液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng),空氣泵 壓力傳感器 壓力調(diào)節(jié)器 石英流動(dòng)室,流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu),流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng),空氣泵 壓力傳感器 壓力調(diào)節(jié)器 石英流動(dòng)室,流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu),激光光源及光束形成系統(tǒng),氬離子激光器 （Argon） 半導(dǎo)體激光器 （He-Ne） 紫外UV激光器 （He-Cd） 按功率大小可 分為水冷/空冷 到達(dá)流動(dòng)室前 經(jīng)透鏡聚焦,流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu),激光光源及光束形成系統(tǒng),氬離子激光器 （Argon） 半導(dǎo)體激光器 （He-Ne） 紫外UV激光器 （He-Cd） 按功率大小可 分為水冷/空冷 到達(dá)流動(dòng)室前 經(jīng)透鏡聚焦,流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu),光學(xué)系統(tǒng)：透鏡、濾光片、小孔，聚焦光源， 收集不同波

12、長(zhǎng)的熒光信號(hào),流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu),光學(xué)系統(tǒng)：透鏡、濾光片、小孔，聚焦光源， 收集不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào),LP-長(zhǎng)通濾光片,SP-短通濾光片,BP-帶通濾光片,DLP、DSP 雙色性長(zhǎng)通 短通濾光片,流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu),光學(xué)系統(tǒng)：透鏡、濾光片、小孔，聚焦光源， 收集不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào),流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu),信號(hào)檢測(cè)與存儲(chǔ)、顯示、分析系統(tǒng)：光電倍 增管（PMT）、補(bǔ)償電路。熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為 電信號(hào)，并將信號(hào)放大,前向角散射光檢 測(cè)（FSC）采用 光電二極管 側(cè)向角散射光檢 測(cè)（SSC）采用 光電二極管 熒光檢測(cè)（FL） 采用光電倍增管,流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu),信號(hào)檢測(cè)與存儲(chǔ)、顯示、分析系統(tǒng)：光電倍增 管( P

13、MT )、補(bǔ)償電路、將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信 號(hào)，并將信號(hào)放大，處理分析。,Log,熒光信號(hào)的線性測(cè)量 與對(duì)數(shù)測(cè)量 熒光信號(hào)的面積測(cè)量 與寬度測(cè)量 熒光光譜的重疊校正,流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu),信號(hào)檢測(cè)與存儲(chǔ)、顯示、分析系統(tǒng)：光電倍增 管( PMT )、補(bǔ)償電路、將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信 號(hào)，并將信號(hào)放大，處理分析。,熒光信號(hào)的線性測(cè)量 與對(duì)數(shù)測(cè)量 熒光信號(hào)的面積測(cè)量 與寬度測(cè)量 熒光光譜的重疊校正,流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu),信號(hào)檢測(cè)與存儲(chǔ)、顯示、分析系統(tǒng)：光電倍增 管( PMT )、補(bǔ)償電路、將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信 號(hào)，并將信號(hào)放大，處理分析。,數(shù)據(jù)存儲(chǔ)采用 列表排隊(duì)方式 數(shù)據(jù)顯示通常 有一維直方圖 二維散點(diǎn)圖、

14、 等高線圖、密 度圖等,流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu),信號(hào)檢測(cè)與存儲(chǔ)、顯示、分析系統(tǒng)：光電倍增 管( PMT )、補(bǔ)償電路、將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信 號(hào)，并將信號(hào)放大，處理分析。,數(shù)據(jù)存儲(chǔ)采用 列表排隊(duì)方式 數(shù)據(jù)顯示通常 有一維直方圖 二維散點(diǎn)圖、 等高線圖、密 度圖等,SS,FS,流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu),細(xì)胞分選系統(tǒng),捕獲管分選和 靜電分選 水滴形成部件 分選邏輯電路 水滴充電及偏轉(zhuǎn),捕獲管分選,流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu),細(xì)胞分選系統(tǒng),捕獲管分選和 靜電分選 水滴形成部件 分選邏輯電路 水滴充電及偏轉(zhuǎn),細(xì)胞分選系統(tǒng),捕獲管分選和 靜電分選 水滴形成部件 分選邏輯電路 水滴充電及偏轉(zhuǎn),流式細(xì)胞儀主要性能指標(biāo),流式細(xì)胞

15、儀可分為科研型（大型機(jī)） 和臨床型（臺(tái)式機(jī)）兩種類型,流式細(xì)胞儀主要性能指標(biāo),流式細(xì)胞儀可分為科研型（大型機(jī)） 和臨床型（臺(tái)式機(jī)）兩種類型,流式細(xì)胞儀主要性能指標(biāo),流式細(xì)胞儀可分為科研型（大型機(jī)） 和臨床型（臺(tái)式機(jī)）兩種類型,流式細(xì)胞儀主要性能指標(biāo),流式細(xì)胞儀可分為科研型和臨床型兩種類型 （臺(tái)式機(jī)）,流式細(xì)胞儀主要性能指標(biāo),流式細(xì)胞儀可分為科研型（大型機(jī)） 和臨床型（臺(tái)式機(jī)）兩種類型 流式細(xì)胞儀會(huì)在硬件上不斷更新，采用更新的器件（如半導(dǎo)體激光、大規(guī)模集成電路），以實(shí)現(xiàn)小型化；用數(shù)字電路取代模擬電路，充分發(fā)揮微處理器的功能以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單化；在軟件上提高數(shù)據(jù)自動(dòng)分析能力，充分發(fā)揮圖形界面的優(yōu)點(diǎn)， 使操

16、作更加簡(jiǎn)便。,流式細(xì)胞儀主要性能指標(biāo),流式細(xì)胞儀可分為科研型（大型機(jī)） 和臨床型（臺(tái)式機(jī)）兩種類型 流式細(xì)胞儀會(huì)在硬件上不斷更新，采用更新的器件（如半導(dǎo)體激光、大規(guī)模集成電路），以實(shí)現(xiàn)小型化；用數(shù)字電路取代模擬電路，充分發(fā)揮微處理器的功能以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單化；在軟件上提高數(shù)據(jù)自動(dòng)分析能力，充分發(fā)揮圖形界面的優(yōu)點(diǎn)， 使操作更加簡(jiǎn)便。,謝謝！,流式細(xì)胞儀小結(jié) 174頁(yè),待測(cè)標(biāo)本制備成單細(xì)胞懸液通過熒光染色后加 壓進(jìn)入充滿鞘液流的流動(dòng)室。(細(xì)胞染色） 鞘液流壓力與樣品流壓力差異達(dá)到一定比例時(shí)，鞘液包裹著樣品流中細(xì)胞排成單列逐個(gè) 經(jīng)過激光聚焦區(qū)。（鞘流技術(shù)） 通過激光檢測(cè)區(qū)的細(xì)胞受激光照射，產(chǎn)生散射 光；部分

17、被標(biāo)上特異性熒光染料的細(xì)胞，產(chǎn)生 特定波長(zhǎng)的熒光。（激光光源）,流式細(xì)胞儀小結(jié) 175頁(yè),通過一定波長(zhǎng)選擇通透性的濾光片，將散射光、 不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)區(qū)分開來，并送到不同的 光電檢測(cè)通道。（散射光檢測(cè)，熒光檢測(cè)） 經(jīng)過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)換、放大，數(shù)字化處理，就 可以在計(jì)算機(jī)上直觀的得到染上各種熒光染料 的細(xì)胞各自的百分率。（各項(xiàng)參數(shù)及散點(diǎn)圖） 細(xì)胞分選功能可以將具有某種特征的細(xì)胞分選 出來，以便進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。（細(xì)胞分選）,血液分析儀復(fù)習(xí),小孔電阻抗法測(cè)定原理 （164頁(yè)） 在負(fù)壓的吸引下血細(xì)胞依次通過小孔， 依次排 開等體積電解液； 小孔截面內(nèi)的電解液電阻值的變化，在恒流源 的負(fù)載電阻上引起等比例的電壓變化，產(chǎn)生電 壓脈沖； 電壓脈沖的個(gè)數(shù)與細(xì)胞個(gè)數(shù)相當(dāng)，脈沖幅度與 細(xì)胞體積成正比。 將脈沖送入相應(yīng)的計(jì)數(shù)通道，通過計(jì)算得到某 類細(xì)胞個(gè)數(shù)。,細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)計(jì)算機(jī)將不同幅度(體積)的脈沖送入 相應(yīng)的計(jì)數(shù)通道并計(jì)數(shù)，得到直方圖。 儀器對(duì)其測(cè)定的直方圖中三種體積不同的白細(xì) 胞進(jìn)行初步分類。,血液分析儀復(fù)習(xí),白細(xì)胞的“三分群”檢測(cè)原理（ 165頁(yè)）,白細(xì)胞分布直方圖 （256或512通道）,細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)使用多項(xiàng)技術(shù)（激光、射頻傳導(dǎo)、電阻抗 細(xì)胞